低温肠内喂养对胃缺血再灌注损伤大鼠影响的实验研究

戴 利，罗利娜，曾秋霞

胃缺血再灌注损伤（gastric ischemia－reperfusion injury，GI－RI）是临床常见的一种病理现象，肿瘤坏死因子－α（TNF－α）在胃缺血再灌注损伤中发挥着重要作用［1，2］。研究表明，低温能抑制缺血再灌注损伤所致的 TNF－α水平，减轻组织损伤［3－5］。为了证实低温肠内喂养是否在胃缺血再灌注损伤中同样具有减轻组织损伤作用，本研究应用大鼠建立胃缺血再灌注模型，灌入不同温度肠内营养液，探讨其作用及可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型及分组 选取健康雄性SD 4月龄大鼠40只，体重250g～280g，肛温37.1℃～38.5℃，由南华大学动物中心提供，实验动物合格证号：SYXK（湘）2010－0006，实验方法符合动物伦理学要求。将大鼠随机分为肠内喂养温度10℃组、24℃组、32℃组、40℃组。实验前禁食18h，自由饮水。按 Wada等［6］方法建立胃缺血－再灌注模型，给予10%水合氯醛腹腔麻醉，仔细分离腹腔动脉及周围组织，用无创动脉夹夹闭腹腔动脉30min后去除动脉夹，关腹。

1.2 肠内营养 选用德国Milupa GmbH公司生产的百普素，为短肽型肠内营养制剂，126g加水配制成500mL，1mL＝1kcal（1kcal＝4.18kJ），所有营养液均于灌胃前30min配制，分别放于已设定温度的恒温水浴箱中。每只大鼠按各自手术时间术后2h开始肠内喂养，第1个24h摄入量为正常大鼠日需总量［200 kcal/（kg·d）］的1/3，第2个24h摄入量为总量的1/2，每日6次按时灌胃。

1.3 主要试剂盒 兔抗TNF－α多克隆抗体（美国Bioworld公 司），大 鼠 TNF－αELISA 试 剂 盒 （Biosource公司）。

1.4 测定样品的制备 大鼠胃缺血再灌注损伤术后48h予深麻醉下取心脏静脉血5mL后开腹取胃并迅速测定胃黏膜损伤指数，留取腺胃测定TNF－α水平。

1.5 胃黏膜损伤指数测定 将每个鼠胃进行编号后由一位不参与实验的观察者在10倍放大镜下测定胃黏膜损伤指数。按Guth等［7］标准：斑点糜烂计1分；糜烂长度＜1mm计2分；1mm～2mm计3分；2mm～4mm计4分；＞4mm计5分；若宽度＞1mm加倍得分。每个胃所得总分即为该鼠的胃黏膜损伤指数。

1.6 胃黏膜TNF－α的表达测定 采用SABC法行TNF－α免疫组化测定，胃黏膜上皮细胞及内皮细胞胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性表达。随机测试5个高倍视野，采用Image－pro plus图像分析软件进行阳性细胞计数，计算每个视野均值。判断结果：①依据阳性细胞数量计分：阳性细胞数为0计0分，≤25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分。②依据细胞着色强度计分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。③数量积分与着色强度积分相加，0分为（－），2分～3分为（±），4分～5分为（＋），6分～7分为（＋＋）。其中（－）和（±）判为阴性，（＋）和（＋＋）判为阳性［8］。

1.7 血清TNF－α含量测定 采用双抗夹心ELISΑ法检测血清TNF－α含量。

1.8 统计学方法 采用SPSS13.0软件对实验数据进行统计学描述、方差分析、Kruskal－WallisH检验、Nemenyi法进行两两比较。采用Pearson、Kendall相关分析，α值界定为0.05。

2 结果

2.1 大鼠术后存活状况 大鼠胃缺血再灌注损伤术后10℃组、24℃组、32℃组、40℃组各有8只、9只、9只、7只存活至实验结束。

2.2 胃黏膜损伤指数 实验各组所有大鼠胃黏膜均可见不同程度的点状、条索状和片状糜烂、溃疡。10℃组胃黏膜损伤指数最低，40℃组最高，除24℃组与32℃组比较差异无统计学意义（P＞0.05）外，其他各组比较均有统计学意义（P＜0.05），见表1。胃黏膜损伤指数与肠内喂养温度呈正相关（r＝0.689，P＜0.01）。

表1 实验各组大鼠胃黏膜损伤指数比较（±s）

表1 实验各组大鼠胃黏膜损伤指数比较（±s）

组别 只数 胃黏膜损伤指数10℃组 8 32.13±6.47 24℃组 9 40.11±7.831）4）32 ℃组 9 44.22±7.352）3）5）40℃组 7 52.14±8.862）

2.3 胃黏膜TNF－α免疫组化结果 各组大鼠胃组织TNF－α阳性表达部位可见于整个黏膜层，但细胞着色强度有很大区别，详见图1。10℃组8只中有3只阳性表达，24℃组9只中有7只阳性表达，32℃组9只中有7只阳性表达，40℃组全部有阳性表达，见表2。各组胃组织TNF－α表达强度比较，10℃组与24℃组、32℃组比较，P＜0.05；10℃组与40℃组比较，P＜0.01；24℃组与40℃组比较，P＜0.05；24℃组与32℃组、32℃组与40℃组比较，P＞0.05。且TNF－α阳性表达程度与肠内喂养温度呈正相关（r＝0.507，P＜0.01）。

图1 4组实验动物胃组织TNF－α阳性表达（×200）

表2 实验各组大鼠胃组织TNF－α表达强度比较 只

2.4 血液 TNF－α的变化 10℃组、24℃组、32℃组、40℃组血液 TNF－α含量分别为（187.83±13.08）ng/L、（199.53±16.64）ng/L、（201.84±11.15）ng/L、（201.93±18.15）ng/L。各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

低温治疗在脑、心肌等多脏器缺血再灌注损伤中的保护作用已得到广泛证实。在低温治疗方法上，学者们发现缺血局部低温治疗相比全身低温治疗，同样展现出良好的治疗效果，且副反应更少，显示出令人振奋的前景［3，9，10］。胃黏膜在遭受严重应激源刺激时会发生不同程度的缺血再灌注（I－R）损伤，为了探讨低温肠内喂养对缺血再灌注后对胃黏膜是否具有保护作用，本研究通过夹闭大鼠胃部供血血管造成胃缺血－再灌注损伤模型，模拟临床病理生理状态，将营养液直接灌入胃内，对比应用不同温度肠内喂养液对胃缺血－再灌注损伤大鼠胃黏膜的影响。结果发现，随着喂养温度的降低，胃黏膜损伤指数下降，提示10℃组低温肠内喂养液对大鼠胃缺血－再灌注损伤后胃黏膜具有保护作用。

有研究表明，机体在胃缺血－再灌注损伤后TNF－α明显增加［1，2］。TNF－α是机体炎症反应中最早、发挥核心作用的内源性炎症介质，是引起机体代谢和血液动力性紊乱，促进其他炎症介质生成，导致炎症因子“瀑布效应”的元凶。TNF－α引起机体急性胃黏膜损伤，其机制可能为：①TNF－α诱导细胞因子，如白细胞介素－1（IL－1）、白细胞介素－6（IL－6）、白细胞介素－8（IL－8）等炎症因子的表达有关；②TNF－α参与中性粒细胞（PMN）的活化，细胞间黏附因子（ICAM）、血管细胞黏附因子（VCAM）等细胞黏附因子的激活，促使PMN黏附于血管内皮细胞，并促使其迁移至炎症组织中；③TNF－α诱导氧化亚氮合成酶的产生，引起氧化亚氮大量释放。本实验研究结果显示，10℃组TNF－α含量最低，表明低温肠内喂养抑制了机体胃黏膜过度的炎症反应水平，其可能原因为低温通过阻断TNF－α的产生，使IL－1、IL－6等炎症介质生成减少，减慢炎症反应速度，减少炎性介质的瀑布样效应来发挥作用。同时，抑制PMN的聚集和激活，减轻对血管内皮的损伤；抑制氧化亚氮的生成。但血液中TNF－α含量虽较其他各组有所降低，却未表现出明显差异，其原因可能为：①肠内营养直接作用于胃内，导致胃黏膜TNF－α的改变可能比血液作用更为明显；②大鼠胃缺血－再灌注损伤后血浆TNF－α虽然上升，但一般5d才达高峰［1］。

从上述结果来看，在再灌注2h开始给予低温肠内喂养，到再灌注48h对大鼠胃黏膜具有保护效果，但低温肠内喂养持续时间以及耐受性、并发症等安全性问题还将有待进一步证实。

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