鼻咽癌和健康人群中EB病毒BARF0基因序列分析

王伟娜，高翔翔，沈智超，罗兵，王云

(1 青岛大学医学院微生物学教研室，山东 青岛 266021；2 中国人民解放军济南军区青岛第一疗养院检验科； 3 青岛市城阳区流亭卫生院)



鼻咽癌和健康人群中EB病毒BARF0基因序列分析

王伟娜1，2，高翔翔3，沈智超1，罗兵1，王云1

(1 青岛大学医学院微生物学教研室，山东 青岛 266021；2 中国人民解放军济南军区青岛第一疗养院检验科； 3 青岛市城阳区流亭卫生院)

目的 了解山东地区鼻咽癌(NPC)及健康人群中EB病毒(EBV)编码BARF0基因变异特征，探讨其变异意义。方法 采用PCR和DNA测序检测NPC组织以及健康成年人咽漱液标本中EBV的BARF0基因序列，与EBV标准株进行比较，根据特征性突变对变异进行分类。结果 73例NPC病人和70例健康人群BARF0成功测序，共检出4处共有突变。其中36例(49.3%)NPC和29例(41.4%)健康人群同时出现4处共有突变(T160473G、T160545C、A160701C和C160707G)，被分类为4M变异型；35例(48.0%)NPC和38例(54.3%)健康人群同时出现除T160473G外的3处共有突变，被分类为3M变异型，其余2例(2.7%)NPC和3例(4.3%)健康人群分类为Others。χ2检验精确概率法分析表明,BARF0变异型在2种人群中的分布差异无统计学意义(P=0.618)。结论 山东地区NPC和健康人群中EBV毒株BARF0序列变异一致，BARF0基因变异的地域性分布及与EBV相关肿瘤的关系值得进一步研究。

疱疹病毒4型,人；染色体结构变异；BARF0基因；鼻咽肿瘤

EB病毒(EBV)与多种人类淋巴细胞和上皮细胞性肿瘤的发生有关[1]。EBV BamHI A右向转录产物(BARTs)是EBV的一组选择性剪接转录产物，在最后一个外显子3′末端均含有一个共同的开放读码框BARF0。BARTs在所有EBV相关肿瘤组织中表达，有研究表明其可通过维持病毒潜伏感染或作为非编码RNA参与EBV致癌过程[2-3]。虽然EBV广泛分布于世界各地，但是鼻咽癌(NPC)等EBV相关肿瘤存在明显的地域性，因此，寻找可能与肿瘤相关的EBV变异株一直是研究的热点之一，但某一特定的EBV基因亚型代表地域相关性变异还是疾病相关性变异尚存在着争议[4]。目前，有关BARTs基因多态性的研究报道较少[5-6]。本研究检测山东地区NPC病人和健康人群中BARF0基因序列，探讨其变异意义，旨在为深入分析BARF0基因变异与肿瘤发生的关系及其生物学功能提供依据。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集及DNA提取

NPC石蜡包埋组织取自青岛大学医学院附属医院和山东大学齐鲁医院病理科，通过原位杂交检测组织标本中EBV编码小RNA1鉴定EBV阳性NPC组织标本，具体步骤参见文献的方法[7]。咽漱液(TW)标本取自健康查体人员，通过PCR检测EBV BamHI W片段筛选和鉴定EBV阳性TW标本[8]。所有病例和健康人群来自相同地区，包括山东省多个地区，其祖籍均为山东且居住在山东的当地人群。采用FFPE石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)提取石蜡包埋组织DNA，使用酚-氯仿-异戊醇法常规提取新鲜组织和TW标本DNA。

1.2 PCR扩增

BARF0位于BARTs 3′末端，长525 bp(B85-8 coodinates 160470-160994)，推测编码含174个氨基酸的蛋白质。根据EBV标准株B95-8(GenBank收录号：V01555)序列，设计扩增BARF0基因的巢式PCR引物，引物序列、在基因组中的位置及扩增片段大小见表1。其中P1和P2为外巢PCR引物，P3和P4为内巢PCR引物。外巢PCR反应体系为20 μL，包括10×Buffer 2.0 μL，MgCl21.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上下游引物各0.4 μmol/L，高保真Taq DNA聚合酶(大连TaKaRa公司)1.0 U，DNA 模板100 ng；取外巢PCR产物1 μL为内巢PCR模板，反应体积为30 μL。循环条件为94 ℃预变性5 min；然后，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，共扩增35个循环；最后72 ℃延伸10 min。取3 μL的 PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳并鉴定。

表1 BARF0基因序列分析所用引物

1.3 DNA测序

取25 μL的PCR扩增产物送上海迈浦生物科技有限公司，采用末端终止法进行双向测序，测序引物为内巢PCR引物。测序结果用Chromas软件查看峰图文件，用DNAStar软件(Lasergene，version 7.0)剪接序列和对排分析，以EBV标准株B95-8序列作为参比序列，同时与基因库中相关序列进行对比分析。

1.4 统计学分析

以PPMS 1.5[9]软件进行统计学处理，采用χ2检验精确概率法分析BARF0基因变异类型在NPC和健康人群之间分布的差异。以P<0.05为差异有显著意义。

2 结 果

2.1 BARF0基因序列多态性

共有73例NPC和70例健康人群标本完成测序。与标准株B95-8比较，所有序列均出现变异，均为单核苷酸突变，其变异情况见图1。共检出22处突变，组成16种DNA序列，其中4处突变见于较多样本，属共有突变，其余18处突变均为见于1～3例样本的散在突变。4处共有突变中，C160707G(2例为T160707G)见于所有的样本中，T160545C和A160701C同时出现于几乎所有的样本(96.5%，138/143)，而T160473G突变则仅见于部分的样本(45.5%，65/143)。根据4处共有突变对BARF0基因变异进行分类，将同时出现上述4处共有突变的序列分类为4M变异型，共同出现其中3处共有突变(T160545C、A160701C和C160707G)的序列分类为3M变异型。2种变异型样本中，多数样本仅具有共有突变，部分样本还伴有其他位点的散在突变。有5例样本除共有突变C160707G(或T160707G)外，未出现其他3处共有突变，但伴有其他位点的散在突变，分类为Others。

图1中同时列出了GenBank中已经完整测序的19株EBV BARF0基因序列，来源于我国NPC高发区NPC的13株EBV毒株(GD1、GD2、M81、C666-1、HKNPC1-HKNPC9，GenBank基因收录号分别为：AY961628、HQ020558、KF373730、KJ411974、JQ009376、KF992564-KF992571)[10-13]和另外来源于日本BL的Akata(KC207813)[14]均为4M变异型；而来源于非洲Burkitt淋巴瘤(BL)的AG876(DQ279927)[15]则为3M变异型，另外MUTU(KC207814)[14]只出现A160701C和C160707G的2处共有突变和1处散在突变，将其归类为Others；来自美国健康成人的K4413Mi和K4123Mi(KC440852和KC440851)[16]与来自美国传染性单核细胞增多症的EBV标准株B95-8一致。

2.2 BARF0基因变异类型在NPC及健康人群中的分布

NPC和健康人群中BARF0基因变异类型的分布见表2。多数样本为3M变异型和4M变异型，少数为Others。BARF0变异类型在2种人群中构成比的差异无统计学意义(P=0.618)。

表2 BARF0基因变异类型在NPC和健康人群中的分布

阴影中序列表示4M和3M变异型的共有序列，每一种序列以1例样本名称表示，括号中的数字表示来自NPC和健康人群与该样本序列相同的样本数量，N：NPC；T：健康人群。GenBank中已测序毒株以斜体表示，包括HKNPC1-HKNPC9、GD1、GD2、M81、C666-1、Akata、AG876、MUTU、B95-8、K4413Mi和K4213[11-17]。

3 讨 论

本研究对山东地区73例NPC和73例健康人群中EBV BARF0基因进行序列多态性分析。与B95-8比较，所有标本BARF0基因均出现单核苷酸突变，无插入和缺失，BARF0基因出现的突变位点少，且不同样本之间变异较为一致。共检出4处共有突变，其中C160707G(或T160707G)、T160545C和A160701C同时出现于几乎所有样本(124/127)。目前仅有广州地区20例NPC组织和19株完成测序的EBV毒株可获知其BARF0序列，其中广州地区20例NPC组织[6]、来源于广东和香港NPC的13株EBV毒株[10-13]、来源于日本BL的Akata毒株和非洲BL的AG876[14-15]均同时出现该3处突变，提示该3处突变是BARF0基因的突变热点。

与上述3处突变不同，T160473G仅见于部分样本，根据其出现与否，将所检测样本中BARF0基因分为4M和3M两种主要变异类型。两种变异型在NPC和健康人群中的分布无显著性差异，提示BARF0变异可能与山东地区NPC发生的易感性无相关性。但值得关注的是，来自NPC高发区的所有20例NPC和13株来源于NPC的EBV毒株均为4M变异型[6,10-13]，而4M变异型在山东地区NPC病人和健康人群中检出率分别为49.3%(36/73)和41.4%(29/70)，提示4M变异型在高发区NPC具有更高的检出率。以往有研究表明，EBV其他潜伏期基因如潜伏膜蛋白1的China 1亚型或核抗原1的V-val亚型在高发区NPC的检出率高于同一地区健康人群，认为它们与NPC的发生相关[4,17]。但有研究显示，China 1或V-val在NPC和健康人群中检出率类似，认为它们与NPC发生无关[4]。张琳琳等[5]研究显示，BARTs A73基因A157154 C突变在广东地区NPC中的检出率高于健康人群。由于目前尚缺乏来自NPC高发区正常人群及其他地域NPC和非NPC人群BARF0基因多态性的报道，BARF0 4M变异型毒株是否在高发区NPC中流行及与NPC的相关性，需要进一步采集不同地区样本及扩大检测样本例数证实。

BARTs的功能尚未明确，但由于其在EBV相关肿瘤组织中普遍表达，尤其在上皮性肿瘤中呈高表达，推测其在肿瘤发生过程中发挥作用[1-2]，其可能反义调节互补链裂解期基因的表达参与维持病毒的潜伏感染[1-2]，可能作为长链非编码RNA而起作用[3]，BARTs体外表达的某些蛋白如RK-BARF0可以通过与Notch相互作用诱导EBV致癌基因潜伏膜蛋白1的表达[18]。本研究4处共有突变在推测的BARF0蛋白中均引起氨基酸突变。由于对该基因功能、作用机制、基因结构等了解较少，因而现在还难以预测这些变异对其功能的影响。BARF0变异的研究，对明确BARF0基因变异的地域分布、与EBV相关肿瘤的关系及生物学意义具有指导意义，为进一步明确EBV基因变异与肿瘤的相关性提供了实验依据。

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(本文编辑 张蓓 于国艺)

SEQUENCE ANALYSIS OF BARF0 GENE OF EPSTEIN-BARR VIRUS IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMA AND HEALTHY CROWD

WANGWeina,GAOXiangxiang,SHENZhichao,LUOBing,WANGYun

(Department of Microbiology, Qing-dao University Medical College, Qingdao 266021, China)

ObjectiveTo investigate the characteristics of polymorphisms of BARF0 gene of Epstein-Barr virus (EBV) in nasopharyngeal carcinoma (NPC) and healthy crowd of Shandong province, and explore the significance of BARF0 gene variations.MethodsEmploying PCR and DNA sequencing, the BARF0 sequences of isolates from NPC biopsies and throat washing samples of healthy persons were detected. The sequences were compared with the EBV type strain, and the variations were classified according to distinctive mutation.ResultsA total of 143 isolates from 73 NPC and 70 healthy donors were successfully sequenced and four common mutations were detected. Thirty-six (49.3%) NPC and 29 (41.4%) healthy donor isolates with four common mutations (T160473G, T160545C, A160701C and C160707G) were arranged into one group and named variant 4M, and 35 (48.0%) NPC and 38 (54.3%) healthy donor isolates with three common mutations (T160545C, A160701C and C160707G) were characterized into one group and named variant 3M. The remaining two (2.7%) NPC and three (4.3%) healthy donor isolates were classified as “Others” group. Chi-square test showed that the distribution of the BARF0 variants among two population groups was not significantly different (P=0.618).ConclusionThe isolates in NPC and healthy donors in Shandong province demonstrates consistent variation pattern. The geographical distribution of the BARF0 variants and the relationship between BARF0 variation and EBV-associated tumors are worth further study.

herpesvirus 4, human; genomic structural variation; BARF0 gene; nasopharyngeal neoplasms

2015-02-09;

2015-04-23

国家自然科学基金(81171571)和青岛市科技局科研基金(13-1-3-50-nsh)资助项目

王伟娜(1984-)，女，硕士研究生。

王云(1970-)，女，博士，教授，硕士生导师。

R373.9;R739.63

A

1008-0341(2015)04-0383-04