早期胃癌hMLH1和hMSH2基因表达及意义

鞠辉，刘希双，夏頔，刘华，张翠萍，江月萍

(青岛大学附属医院，山东 青岛 266003 1 消化内科； 2 急诊内科)



早期胃癌hMLH1和hMSH2基因表达及意义

鞠辉1，刘希双1，夏頔2，刘华1，张翠萍1，江月萍1

(青岛大学附属医院，山东 青岛 266003 1 消化内科； 2 急诊内科)

目的 探讨早期胃癌胃黏膜组织hMLH1和hMSH2蛋白的表达及其意义。方法 选取内镜下切除早期胃癌组织45例、癌前病变组织38例以及胃镜下活检慢性胃炎组织42例，采用免疫印迹法检测hMLH1和hMSH2蛋白的表达。结果 慢性胃炎及癌前病变组织hMLH1蛋白表达高于早期胃癌组织，差异有统计学意义(F=9.578，P<0.05)；早期胃癌组织hMSH2蛋白表达高于癌前病变与慢性胃炎组织，差异有统计学意义(F=32.952，P<0.05)。早期胃癌病人hMSH2及hMLH1蛋白表达与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、浸润深度、组织学类型等无关(P>0.05)。幽门螺杆菌(Hp)感染组早期胃癌组织hMSH2阳性表达率低于非Hp感染组(χ2=22.361，P<0.05)，癌前病变、慢性胃炎组织hMSH2阳性表达率也低于非Hp感染组，但差异无统计学意义(P>0.05)；Hp感染组早期胃癌、癌前病变和慢性胃炎组织hMLH1阳性表达率均低于非Hp感染组，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 在慢性胃炎、癌前病变和早期胃癌的发展过程中，hMSH2基因表达增加，hMLH1基因表达减少。Hp感染可能通过影响hMSH2与hMLH1基因表达，影响早期胃癌的发生。

胃肿瘤；癌前状态；DNA错配修复；幽门螺杆菌

早期胃癌是指癌组织仅限于胃黏膜层与黏膜下层，不论有无淋巴结转移[1]。早期胃癌的早期诊断与治疗可提高胃癌的治愈率。目前胃癌的发生机制不明，近来研究表明，错配修复基因(MMR)的突变参与肿瘤的发生，MMR基因中hMLH1和hMSH2的异常改变与胃肠道肿瘤发生有关[2-3]。幽门螺杆菌(Hp)感染也被认为是胃癌发生原因之一，但是目前机制不明。既往我们分析了胃癌、癌旁组织与慢性胃炎组织中hMLH1和hMSH2的表达[4]，本文进一步分析早期胃癌、癌前病变(低级别上皮内瘤变)以及慢性胃炎组织中hMLH1和hMSH2基因表达及其与Hp感染的关系。

1 材料和方法

1.1 标本及其来源

标本均取自我院消化内镜中心切除或活检的胃黏膜组织。早期胃癌组织45例，术后病理检查为高级别上皮内瘤变、高分化腺癌等；其中男28例，女17例，平均年龄为(50.3±10.6)岁。癌前病变组织38例，病理活检为低级别上皮内瘤变；其中男26例，女12例，平均年龄为(45.3±9.4)岁。慢性胃炎组织42例，其中慢性非萎缩性胃炎24例，慢性萎缩性胃炎18例；男24例，女18例，平均年龄为(52.3±11.5)岁。将上述标本取出后进行标记号码，统一置于-70 ℃冰箱保存备用。

1.2 蛋白样品制备与免疫印迹检测

分别取早期胃癌、癌前病变及慢性胃炎黏膜组织，捣碎，裂解，高速离心15 min。取50 μg上清液在凝胶上恒压电泳分离3 h，转移至PVDF膜上，室温封闭2 h，加入一抗(抗hMSH2、抗hMLH1小鼠单克隆抗体，SANTA CRUZ生物公司)，在4 ℃下与PVDF膜混合过夜。以TBS液洗涤4次，每次20 min，再与二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，联科生物公司)结合，室温放置2 h，然后再以TBS液洗3次，每次20 min。倒入ECL发光液，充分混合后，以保鲜膜覆盖，暗盒中放置5 min，观察结果。应用BIO-RAD图像分析软件进行分析，设空白对照相对密度值为0，以hMSH2及hMLH1蛋白表达的条带灰度值与GAPDH条带灰度值比值表示各病变组织的表达水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同组织hMSH2和hMLH1蛋白表达比较

慢性胃炎及癌前病变组织hMLH1蛋白的表达高于早期胃癌组织，差异有统计学意义(F=9.578，P<0.05)；慢性胃炎与癌前病变组织比较，差异无统计学意义(P>0.05)。慢性非萎缩性胃炎组织hMLH1蛋白表达与萎缩性胃炎组织比较，差异无统计学意义(P>0.05)。早期胃癌组织hMSH2蛋白表达均高于癌前病变与慢性胃炎组织，癌前病变组织高于慢性胃炎组织，差异均有统计学意义(F=32.952，P<0.05)。见图1、表1。

2.2 hMSH2和hMLH1蛋白表达与早期胃癌临床病理特征的关系

早期胃癌病人hMSH2和hMLH1蛋白表达与病人年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、浸润深度、组织学类型等无关(P>0.05)。见表2。

2.3 不同组织hMSH2和hMLH1基因表达与Hp感染的关系

Hp感染组早期胃癌组织hMSH2基因的表达阳性率低于非Hp感染组(χ2=22.361，P<0.05)，癌前病变、慢性胃炎组织hMSH2阳性表达率也低于非Hp感染组，但差异无统计学意义(P>0.05)；Hp感染组早期胃癌组织、癌前病变组织和慢性胃炎组织hMLH1阳性表达率均低于非Hp感染组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

①、③早期胃癌组织；②、④癌前病变组织；⑤慢性胃炎组织。

表1 各组织hMSH2和hMLH1蛋白表达比较

表2 hMSH2和hMLH1蛋白表达与早期胃癌临床病理特征的关系

3 讨 论

肿瘤的发生过程中包括多个癌基因的激活和抑癌基因的失活。MMR基因由一系列酶分子组成，能够在DNA修复过程中识别错配碱基，消除不配对碱基，具有修复DNA碱基错配、增强DNA复制忠实性、维持基因组稳定性和降低自发性突变的功能[5-6]。hMSH2和hMLH1是MMR家族中较为重要的基因，如果出现异常，可能会导致细胞错配修复功能缺陷，表现为复制错误或微卫星不稳定，因而易发生肿瘤[7-8]。hMSH2基因位于染色体2p22-21，基因全长73 000 bp，其中含有16个外显子，cDNA全长3 116 bp，其开放阅读框架长为2 727 bp，编码909个氨基酸序列[9-10]。hMLH1基因则位于染色体3p21.3-23，基因全长58 000 bp，含有19个外显子，cDNA开放阅读框架长2 268 bp，编码765个氨基酸序列[3,11]。hMSH2蛋白易与hMSH6、hMSH3蛋白分别形成复合体，识别错配位点，启动错配修复[12]。hMLH1可与hMLH3形成复合物，协助hMLH1完成修复功能。但是大部分hMLH1基因可能会突变形成终止密码,导致蛋白翻译不能完成，致使其修复基因功能不全,导致肿瘤发生[13]。

表3 各组hMSH2和hMLH1基因表达与Hp感染的相关性(例(χ/%))

通常认为，胃癌发生是一个多病因、多阶段的连续过程，包括慢性胃炎、癌前病变和胃癌(包括早期胃癌)[1,14]。本文结果显示，早期胃癌组织hMSH2蛋白的表达高于癌前病变和慢性胃炎组织，考虑hMSH2蛋白在胃癌中高表达的原因可能为，在某些因素的不断刺激下，一些增殖活跃的细胞容易出现基因的多点突变和DNA复制错误，使hMSH2基因表达代偿性上调，但增多的基因产物仍不足以修复已发生损伤的基因，使细胞恶性转化，也不排除hMSH2基因自身可能发生突变，编码有缺陷的产物增加，促进肿瘤的发生。一些分化未成熟细胞，其DNA表达出现碱基错配或缺失，需要错配基因修复系统的修复[3]，此时MMR基因尤其是hMSH2与hMLH1表达就会发生改变，这种改变在消化道、生殖腺等组织变化更为明显[15]。既往研究结果显示，hMSH2蛋白在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织和胃炎黏膜组织，癌旁组织hMSH2的表达较胃炎组织明显增多，表明癌细胞旺盛的增殖活动对hMSH2基因表达具有上调作用[16]。LEACH等[17]研究显示，在原发性膀胱癌病人的膀胱冲洗液中hMSH2阳性表达增加。但也有一些研究结果显示，在某些肿瘤组织中hMSH2基因表达减少或缺失，而hMSH2表达下调或缺失的肿瘤通常伴有微卫星不稳定性，微卫星的不稳定性反映了错配修复系统的缺陷[18-19]。

本文的研究结果显示，早期胃癌病人hMLH1和hMSH2的表达与其年龄、性别及肿瘤部位、组织学类型、浸润深度、分化程度等无关。既往有研究显示，消化系统恶性肿瘤中MMR基因表达与病人的年龄、性别及肿瘤部位、组织学类型、浸润深度、分化程度、肿瘤分期、有无淋巴结转移等无关[4,20]。但也有研究表明，不同性别、年龄结肠癌病人hMLH1基因甲基化表达存在差异，并且其表达呈增加趋势，导致hMLH1基因表达减少[21]。

本文研究结果还显示，早期胃癌组织hMLH1基因表达明显低于癌前病变组织及慢性胃炎组织，表明hMLH1的高表达在一定程度上可能会抑制DNA突变或损伤所造成的细胞恶变趋势，进而抑制恶性肿瘤的发生。hMLH1在执行错配修复时与hPMS2构成异源二聚体hMutLα，具有提高与错配修复基因结合效率的功能[22]。hMLH1表达下调的原因，可能是基因突变引起的表达缺失，而更可能的是因为启动子区域甲基化。hMLH1表达下调导致错配修复效率下调，造成突变的累积及肿瘤的发生。一般认为，慢性萎缩性胃炎、低级别上皮内瘤变是胃癌发生发展中的一个阶段。本研究癌前病变组与慢性胃炎组相比，hMLH1基因表达减少，但差异无统计学意义，这可能在一定程度上预示病变进一步发展，最终可能发生胃癌。既往某些研究结果与本文结果相似，BAEK等[23]研究显示，大部分胃癌病人可见hMLH1表达缺失或减少；PEIRO等[24]研究显示，子宫内膜癌病人MLH1表达缺失。

既往认为Hp感染导致胃癌一般遵循从慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎、不典型增生到胃癌的演变过程[1]。一般认为，Hp侵袭胃黏膜引起的慢性炎症可导致大量氧自由基的产生，部分代谢产物为基因毒性物质[25]。本文结果显示，Hp感染组早期胃癌组织hMLH1、hMSH2阳性表达率显著低于非Hp感染组，而Hp感染组癌前病变和慢性胃炎组织hMLH1、hMSH2阳性表达率与非Hp感染组比较差异无显著意义，但是表达水平存在下降的趋势，提示Hp感染可能对hMLH1、hMSH2表达有影响，其机制目前不明确。有研究结果表明，向胃黏膜培养细胞液中加入Hp后，hMLH1和hMSH2的表达均有所下降[26]。

综上所述，在慢性胃炎、癌前病变、早期胃癌的疾病发展过程中，hMSH2基因表达增加，hMLH1基因表达减少。Hp感染可能通过影响hMSH2和hMLH1基因表达，影响早期胃癌的发生。但仍有许多问题，如慢性萎缩性胃炎、癌前病变、早期胃癌与MMR家族其他修复基因的关系等，今后需要进一步研究。

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(本文编辑 马伟平)

THE EXPRESSIONS AND SIGNIFICANCE OF HMLH1 AND HMSH2 IN EARLY GASTRIC CANCER

JUHui,LIUXishuang,XIADi,LIUHua,ZHANGCuiping,JIANGYueping

(Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo explore the expressions of hMLH1 and hMSH2 proteins in mucous membrane of early-stage gastric cancer and their significance.MethodsSamples from 45 cases of early gastric cancer resected through endoscopic surgery, and 38 cases of premalignant lesions were collected, and 42 cases of chronic gastritis confirmed by gastroscopic biopsies were collected as well. The expressions of hMLH1 and hMSH2 in three kinds of the tissues were detected using Western blotting.ResultsThe expression of hMLH1 in chronic gastritis and precancerous lesions was higher than that in early gastric cancer, the difference was statistically significant (F=9.578,P<0.05); the expression of hMSH2 in early gastric cancer was higher than that in chronic gastritis and precancerous lesions (F=32.952,P<0.05). The expressions of hMLH1 and hMSH2 protein in early gastric cancer were not correlated with patient’s age and sex, location and size of tumor, depth of infiltration and histological type (P>0.05). The positive rate of hMSH2 in early gastric cancer infected with Hp was lower than that in non-Hp-infected (χ2=22.361,P<0.05), the expression of hMSH2 in precancerous lesions and chronic gastritis was also lower than that in non-Hp-infected group, but the difference was not statistically significant (P>0.05).ConclusionIn the development process from chronic gastritis to precancerous lesions to early gastric cancer, the expression of hMSH2 increases and that of hMLH1 decreases. Hp infection impacts the occurrence of early gastric cancer probably through affecting the expressions of both hMSH2 and hMLH1.

stomach neoplasms; precancerous conditions; DNA mismatch repair;Helicobacterpylori

2015-03-11;

2015-06-05

鞠辉(1980-)，男，博士研究生，主治医师。

刘希双(1964-)，男，博士，主任医师，博士生导师。

R735.2

A

1008-0341(2015)04-0415-04