流式细胞术检测肺泡灌洗液淋巴细胞免疫表型的临床意义探讨

杨红 鹿英英 张中

流式细胞术检测肺泡灌洗液淋巴细胞免疫表型的临床意义探讨

杨红 鹿英英 张中

目的 探讨流式细胞术检测支气管肺泡灌洗液(BALF)淋巴细胞免疫表型的临床意义。方法 应用流式细胞仪双色直接免疫荧光法对15例肺癌(肺癌组)和20例肺良性病变患者(良性病变组)的支气管肺泡灌洗液T淋巴细胞亚群进行分析。结果 肺癌组肺泡灌洗液中、、比值均低于良性病变组, 差异有统计学意义(P＜0.05), 肺癌组肺泡灌洗液中高于良性病变组, 差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 肺部恶性肿瘤细胞免疫功能低下, 可以通过流式细胞术检测肺泡灌洗液淋巴细胞免疫表型, 为临床诊断肺部良、恶性病变提供有效依据。

肺泡灌洗液；流式细胞术；淋巴细胞免疫表型

流式细胞术具有高灵敏度、高速度和多参数分析的优势,其对血液中淋巴细胞免疫表型的分析, 为血液病、肿瘤、免疫性系统疾病的诊治、器官移植、排斥反应的监测提供重要依据。故流式细胞术被认为是淋巴细胞免疫表型分析的标准方法, 也是最主要的临床应用之一［1］。支气管镜的检查, 可以直接获取患者下呼吸道及肺泡上皮表面的肺泡灌洗液, 对其进行淋巴细胞免疫表型的检测, 是反映肺局部细胞免疫功能状态的重要指标, 可为肺部结节病、肺间质纤维化、肺部恶性肿瘤等疾病的鉴别诊断和疗效观察提供帮助［2］, 其在临床和实验研究中受到广泛重视。但是, 由于检测方法的局限性, 应用流式细胞仪检测肺泡灌洗液淋巴细胞免疫表型的方法, 国内尚未能普遍开展, 且报道甚少［3］。本院应用流式细胞仪检测了15例肺癌患者和20例肺良性病变患者支气管肺泡灌洗液的淋巴细胞免疫表型, 探讨其对肺部良、恶性疾病的鉴别诊断价值。具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 肺癌患者(肺癌组)共15例, 男11例, 女4例, 年龄31~75岁, 平均年龄56.5岁, 其中11例有吸烟史,全部经纤维支气管镜及活组织病理确诊。其中鳞癌8例, 小细胞未分化癌5例, 细支气管肺泡癌1例, 1例未确定细胞类型。肺部良性病变患者(良性病变组)20例, 男16例, 女4例, 年龄32~76岁, 平均年龄49.5岁, 其中肺结核3 例, 肺炎8 例, 肺结节病 7 例, 支气管扩张症2例。

1.2 仪器与试剂 仪器：美国 BD FACSCalibur 流式细胞仪；试剂：双色标记荧光抗体 IgG1/IgG2a、CD45/CD14、CD3/CD4、CD3/CD8、红细胞裂解液、荧光校准微球 calibrate Beads 3-colour , 均购自美国 BD 公司。

1.3 方法

1.3.1 BALF的制备 取新鲜 BALF 10 ml, 经300目金属网过滤去掉杂质和痰液, 300 g, 5 min离心后弃上清, 再用含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次, 取BALF 100 μl加入20 μl荧光抗体, 室温避光孵育20 min, 300 g, 5 min离心弃上清, 加 1∶9 配制的溶血素2 ml, 避光10 min, 200 g, 5 min离心弃上清液, 加入 PBS 缓冲液300 g, 5 min 离心, 弃上清, 加0.5 ml PBS重悬细胞上机待测。

1.3.2 流式细胞仪测定 以荧光微球calibrite Beads 3-colour校准仪器光路使其分辨率达到最佳工作状态, 双色免疫荧光染色, 采用Simultest 软件, 三色荧光/侧向散射光设门(CD45-PerCP/SSC-Gating), 设置淋巴细胞门并分析淋巴细胞免疫表型, 建立CD45-PerCP/SSC, FSC/SSC, SSC/CD3荧光点图, 用CD3细胞群圈门以排除巨噬细胞、碎片及其他成分的干扰, 调节 FSC、SSC 电压, FSC 阈值, FL1-FL2% 、FL2-FL1% 荧光补偿, 每管获取1.5万个细胞, 建立、散点图, 根据同型对照设门分析和Ts的表达情况, 同时计算出 Th/Ts 比值。

1.4 统计学方法 应用SPSS11.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示, 采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

肺癌组和良性病变组肺泡灌洗液淋巴细胞免疫表型的结果比较, 差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 肺癌组和良性病变组淋巴细胞免疫表型的结果比较

表1 肺癌组和良性病变组淋巴细胞免疫表型的结果比较

注: 与良性病变组比较,aP＜0.05

组别例数CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4+/CD8+良性病变组2065.3±6.944.2±3.526.1±1.731.73±0.13肺癌组15 51.2±2.9a35.3±2.61a29.6±1.90a1.41±0.11a

3 讨论

3.1 肺泡灌洗液中含有以T淋巴细胞为主的免疫细胞［4］。T淋巴细胞是一群功能不同的异质性淋巴细胞, 按细胞表面标志不同, 可以分为T淋巴细胞和T淋巴细胞两个群。T淋巴细胞经抗原刺激后在不同细胞因子综合作用下分化发育成辅助T淋巴细胞Th1或Th2, Th1细胞促进细胞免疫, 抑制体液免疫, 而Th2则促进体液免疫, 抑制细胞免疫, 二者的平衡决定着免疫应答的方向［5］。T淋巴细胞是机体细胞免疫主要效应细胞［6］。

3.2 流式细胞仪结合免疫荧光技术提高了肺泡灌洗液中T淋巴细胞亚群检测的便捷和可靠性［7］, 并以散点图的形式直观地显示出不同疾病时T淋巴细胞亚群的变化, 可作为反映肺局部细胞免疫状态的一项免疫指标［8］。

3.3 肿瘤患者常处于免疫功能低下状态, 肿瘤细胞可以产生一系列逃避抗肿瘤免疫反应的机制［9］。有学者认为机体发生肿瘤时, 在肿瘤局部的微环境发生免疫功能紊乱, Th、Ts平衡打破, 表现为局部的Ts亚群增高, Th/Ts比值减低［10］。本文肺癌组BALF中的比值明显低于良性病变组, 与文献报道一致。Ts细胞所占百分比增高, 提示肺癌患者局部细胞免疫功能紊乱, 是肿瘤发生发展的原因［11］。支气管肺泡灌洗液T淋巴细胞亚群的改变对肺部疾病的鉴别诊断有重要意义, 为临床提供有效依据及辅助方法［12-14］。

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Investigation of clinical significance by flow cytometry for lymphocyte immunophenotyping detection in alveolar lavage fluid

YANG Hong, LU Ying-ying, ZHANG Zhong.Department of Inspection, Beijing Fengtai Hospital, Beijing 100070, China

Objective To investigate clinical significance of flow cytometry for lymphocyte immunophenotyping detection in bronchial alveolar lavage fluid (BALF).Methods Flow cytometry double color direct immunofluorescence method was applied in analysis of T lymphocytes subset in bronchial alveolar lavage fluid in 15 lung cancer cases (lung cancer group) and 20 lung benign lesion cases (benign lesion group).Results The lung cancer group had lower values ofratio in alveolar lavage fluid than the benign lesion group, and their difference had statistical significance (P＜0.05).The lung cancer group had highervalue than the benign lesion group, and their difference had statistical significance (P＜0.05).Conclusion The immunity function in lung cancer patients significantly decreases, and their lymphocyte immunophenotyping in alveolar lavage fluid can detected by flow cytometry, for providing effective reference for clinical diagnosis of benign and malignant lesion.

Alveolar lavage fluid; Flow cytometry; Lymphocyte immunophenotyping

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.17.006

2015-01-27］

100070 北京丰台医院检验科(杨红), 呼吸科(鹿英英张中)