实时荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌在结核性胸膜炎诊断中的价值

宋予娟 王华 李爱新 耿岚 吴园园 韩玉芳

实时荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌在结核性胸膜炎诊断中的价值

宋予娟 王华 李爱新 耿岚 吴园园 韩玉芳

目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测结核分枝杆菌在结核性胸膜炎诊断中的价值。方法 对362例临床确诊的结核性胸膜炎患者、可疑结核性胸膜炎患者和非结核性胸膜炎患者的胸水标本采用涂片、实时荧光定量PCR两种方法进行检测, 对其结果进行对比分析。结果 362例胸水标本中, 涂片阳性率为4.42%(16/362), PCR检测阳性率为24.31%(88/362)。胸水涂片、PCR检测102例临床确诊的结核性胸膜炎患者胸水标本阳性率分别为11.76%(12/102)和50.98(52/102)；检测160例临床可疑结核性胸膜炎患者胸水阳性率分别为2.50%(4/160)和22.50%(36/160)。两种方法的阳性检测率比较差异有统计学意义(χ2=10.654, P＜0.05)。100例非结核性胸膜炎患者胸水标本涂片及PCR检测均为阴性。结论 荧光定量-聚合酶链反应(FQ-PCR)快速诊断结核性胸膜炎与涂片法相比较具有快速、灵敏、高特异性等优点。

结核分枝杆菌；胸水涂片；荧光定量聚合酶链反应；结核性胸膜炎

结核分枝杆菌(mucobacterium tuberculosos, MTB)是兼性的细胞内致病菌, 它能够导致进行性疾病和无症状的潜伏感染, 其中潜伏感染占世界人口的1/3, 并且每年有900万新增结核病例, 200万人死于结核病［1］。本次采用荧光定量PCR技术检测临床标本中结核分枝杆菌并与涂片抗酸染色两种方法, 对胸水标本进行检测, 以评价FQ-PCR检测结核分枝杆菌在结核性胸膜炎诊断中的应用。现报告如下。

1 资料与方法

定量PCR方法取胸水约15 ml离心处理后如含少量细胞用双蒸馏水洗涤沉淀2次, 采用DNA提取试剂盒提取胸水DNA,根据深圳凯杰公司荧光定量PCR扩增试剂盒说明书操作。涂片抗酸染色：按照中国结核病防治规划《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》中要求进行操作［3］。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计学软件进行数据统计分析。计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

1.1 一般资料 2011年1月～2014年3月本院住院和门诊胸部影像学诊断为胸腔积液的患者362例。其中临床确诊：102例结核性胸膜炎, 160例可疑结核性胸膜炎, 100例非结核性胸膜炎(其中肺癌12例, 其他呼吸系统疾病患者88例)全部患者根据X线、细菌学、免疫学、病理学等检查进行了确诊。

1.2 试剂与仪器 抗酸染色试剂为珠海贝索生物技术有限公司生产, 实时荧光定量PCR检测试剂为深圳凯杰公司生产的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒。仪器采用上海宏石SLAN实时荧光定量PCR扩增仪。

1.3 方法 患者经胸腔穿刺及胸膜活检, 送检胸腔积液查常规、生化、病理学、涂片抗酸染色及结核杆菌培养。荧光

2 结果

362例胸水标本中, 涂片阳性率为4.42%(16/362), PCR检测阳性率为24.31%(88/362)。102例结核性胸膜炎患者胸水标本涂片和FQ-PCR检测结果：两种方法检测阳性率比较差异有统计学意义(χ2=10.021, P＜0.05)。160例可疑结核性胸膜炎患者胸水涂片和FQ-PCR检测结果, 两种方法检测阳性率比较差异有统计学意义(χ2=10.654, P＜0.05)。对于临床确诊和可疑结核性胸膜炎患者的胸水标本FQ-PCR阳性率分别是涂片的4.33(50.98%/11.76%)倍和9.00(22.50%/2.50%)倍。100例非结核性胸膜炎患者胸水标本涂片和FQ-PCR检测结果均为阴性。见表1, 表2。

表1 102例结核性胸膜炎患者胸水标本涂片和FQ-PCR检测结果比较(n, %)

表2 160例可疑结核性胸膜炎患者胸水标本涂片和FQ-PCR检测结果(n, %)

3 讨论

结核病目前的主要途径和手段还是以细菌学检查为主,如涂片镜检分离培养菌型鉴定及药敏实验等。实时FQ-PCR技术自1996年问世以来短短几年就以其独特的优势在生命科学的基础研究和应用研究方面发挥巨大的作用, 本研究建立的FQ-PCR特异性、敏感性、质量性均较好。对102例确诊结核性胸膜炎, 160例可疑结核性胸膜炎, 100例非结核性胸膜炎患者的胸水标本进行结合分型杆菌检测, 结果显示涂片和实时荧光定量检测阳性率分别为11.76%、50.98%、2.50%、22.50%和0、0, 说明荧光PCR技术可有效检测标本中特异基因片段, 而涂片镜检无法检测。FQ-PCR阳性率,较涂片法显著增高, 且差异有统计学意义(P＜0.05)。其原因可能有当标本中MTB浓度＞10 ml时涂片染色法才可检出, MTB在标本中少聚集成团导致图片分布不匀［3］, 染色过程中冲洗操作很有可能导致载玻片上的MTB流失。本研究102例确诊的结核性胸膜炎患者中50例FQ-PCR检测为阴性,可能是扩增中存在DNA聚合酶的抑制物或者患者此时不排菌, 需要对患者进行间断性FQ-PCR定量动态观察。另在160例可疑结核性胸膜炎患者胸水中检测到36例阳性, DNA测序分析确诊为阳性, 说明其具有很高的敏感性［2］。

综上所述, FQ-PCR对于结核性胸膜炎具有较高的诊断、治疗价值。其敏感、特异、污染少的可动态定量方法有利于临床患者的动态观察和疗效观察, 也有利于结核病的控制。

［1］ 吴睿彦, 陈志成, 肖芃, 等.结核分枝杆菌定量聚合酶链反应对结核性脑膜炎早期诊断价值.实用医学杂志, 2012, 28(17): 2867-2869.

［2］ 金建东.TB-SA结核分支杆菌抗体检测对结核性胸膜炎的诊断意义.临床肺科杂志, 2013, 18(2):299-300.

［3］ 李锐成, 刘昕阳, 阎琳, 等.实时荧光定量聚合酶链反应技术在结核性脑膜炎诊断价值.临床荟萃, 2014, 29(1):31-34.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.09.067

2014-11-19］

453000 新乡市第一人民医院检验科(宋予娟 王华 吴园园 韩玉芳)；新乡市中心血站(李爱新)；新乡市传染病医院(耿岚)