肝脾舒对肝硬化大鼠内毒素血症的影响

刘晓琳

肝脾舒对肝硬化大鼠内毒素血症的影响

刘晓琳

目的 探讨肝脾舒对肝硬化大鼠血浆内毒素是否有调节作用。方法 雄性SD大鼠36只,随机分为正常组、模型组、肝脾舒组、杜秘克组, 每组9只。正常组：每日腹腔注射生理盐水, 模型组：采用40%CCl4橄榄油溶液腹腔注射制备肝硬化模型, 肝脾舒组在此基础上每日给予肝脾舒灌胃, 杜秘克组在模型组基础上每日给予杜秘克灌胃。取血检测血浆内毒素(LPS)水平。结果 3个月后模型组大鼠血浆内毒素水平较正常组升高(P＜0.05)；与模型组相比, 肝脾舒组血清内毒素水平降低(P＜0.05)。结论 肝脾舒对肝硬化大鼠血浆内毒素水平有调节作用。

四氯化碳；肝硬化；肝脾舒；内毒素

1 材料与方法

1.1 主要试剂

四氯化碳由成都科龙化工试剂厂生产, 批号：150508。

内毒素(lipopolysaccharide, LPS)试剂盒为南京建成科技有限公司的产品。

1.2 分组与处理

雄性SD大鼠, 36只, 清洁级, 体重(200±20)g, 购自中科院实验动物中心, 饲养在上海中医医院实验动物中心。所有动物在有恒温、恒湿及昼夜光线变化的房间里饲养, 自由进食、进水, 适应性饲养一周后开始实验。

造模：本实验选用四氯化碳法造模 , 将大鼠按体重分数予以40%CCl4溶液腹腔注射 , 0.3 ml/100 g体重, 首剂加倍,隔日1次, 造模90 d形成肝硬化模型。

分组：将36只大鼠随即分为4组, 正常组、模型组、肝脾舒组、杜秘克组, 每组9只。

给药：各组在造模同时给药, 肝脾舒组20 ml/kg灌胃,正常组、模型组则用同等容量的生理盐水灌胃, 杜秘克组按每日0.01mg/kg体重灌胃, 各组连续给药90 d, 自由饮水, 普通饲料喂养。

检测指标：实验90 d后, 即用乌拉坦(1.25 g/kg)行腹腔麻醉, 取血检测血浆中内毒素水平, 取肝左叶于10%中性甲醛固定后行HE染色。

1.3 检测方法 ①血清指标检测 检测血浆中内毒素水平 操作步骤按试剂盒说明书严格进行 采用723 型分光光度计检测②肝、回肠组织HE染色 经甲醛固定后取肝组织及回肠组织石蜡包埋 切片脱蜡水化 常规HE染色后普通光镜下观察肝组织及回肠组织病理变化。

1.4 统计学方法 所有数据均采用SPSS16.0统计学软件分析。多组间比较以均数±标准差 ( x-±s)表示, 采用单因素方差分析, 两两比较方差齐时用LSD-t法, 方差不齐时用Dunnett'sT3 法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 与正常组相比, 模型组血浆内毒素水平升高(P＜0.05),与模型组相比, 肝脾舒组血浆内毒素水平降低(P＜0.05), 而杜秘克组血浆内毒素水平与模型组相比, 虽有所降低, 但差异无统计学意义(P＞0.05)。各组大鼠血浆内毒素水平见表1。

表1 各组大鼠血浆中内毒素水平( x-±s)

2.2 肝组织HE染色结果 正常组大鼠肝组织结构完整、清晰, 肝小叶正常, 肝细胞排列规则成索状, 在中央静脉周围呈放射状分布, 肝血窦结构清晰, 无异常改变。肝细胞呈多边形, 胞浆均匀, 细胞核形态正常；模型组大鼠肝组织结构松散、紊乱、有大量点状坏死及灶状坏死、肝索消失, 肝间质广泛纤维组织增生, 将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团(即假小叶形成)；肝脾舒组肝小叶结构受损, 少数肝细胞气泡样变性但仅偶见坏死细胞, 少量纤维组织增生, 但未见形成间隔；杜秘克组肝小叶结构被破坏, 部分肝细胞气泡样变性并伴有细胞坏死, 纤维组织增生, 但较少形成间隔。回肠HE染色显示正常组大鼠肠绒毛排列整齐, 结构完整, 长短基本一致, 无绒毛倒伏、脱落现象。模型组大鼠肠绒毛缩短、表面长短不一、结构紊乱、大部分绒毛出现断裂及坏死脱落、肌层增厚；肝脾舒组和杜秘克组肠绒毛局部变短、排列基本整齐、结构尚完整, 部分绒毛有脱落、倒伏情况好转, 肌层增厚。

3 讨论

肝硬化患者易发生全身各系统严重并发症, 病死率高,临床和实验研究均充分证实了肠屏障功能障碍在肝硬化并发症的发展中所起的关键作用［1-3］。肝硬化患者常伴有肠源性内毒素血症( intestinal endotoxemia, IETM)［4］, 而肠黏膜屏障损伤是形成IETM的关键环节, 肠道黏膜下固有层含有大量的肥大细胞, 其活化脱粒可释放大量炎性介质加重肝细胞损伤, 促进肝硬化的发展［5］。肝硬化肠道功能异常导致腔内细菌过度繁殖和内毒素的产生, 后者可进入体循环导致内毒素血症, 内毒素可激活白细胞产生和释放炎症介质, 如白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IF-γ、一氧化氮(NO)诸如此类, 可引起循环衰竭和远端器官衰竭,造成肠道和肝脏损伤的进一步加重, 并造成肠屏障功能-内毒素血症-脏器循环衰竭的恶性循环［6,7］。

作者在长期的医疗实践中, 充分把握肝脏生理病理特点,认为肝为将军之官, 其病多实多热, 脾为后天之本, 其病多虚多寒。结合现代医学病因学, 肝硬化的病因多为HBV、HCV等各种病毒侵袭人体, 羁留体内, 长期不愈(HBV、HCV等属中医疫毒湿邪范畴)；或是长期饮酒；或是长期过食膏脂厚味等, 形成肝病多实证热证的病理特点。王灵台教授是全国有名的中西医肝病专家, 作者曾有幸随从临证学习, 深受其学术影响。王老在“病证并重辨证论治”的学术思想引导下,早年即以清肝为主立法, 组方“清肝颗粒”治疗急慢性肝病,临床及实验表明, 可显著改善患者肝功能并抑制病毒复制［8］。肝与脾的关系, 是木与土的关系, 肝病实, 易乘脾犯胃, 造成脾虚。所以古张仲景有“见肝之病, 知肝传脾, 当先实脾”的说法。脾虚的典型症状“纳呆、腹胀、便溏”等亦是肝硬化患者的常见症状, 实际是和现代医学肠道的功能密切相关的。所以作者秉承王老的学术影响, 以清肝实脾立法, 组方肝脾舒(GPS), 药物组成：虎杖、生白术、枳实、当归、广郁金, 临床灵活化裁, 随证加减用于各型肝硬化患者, 均取得满意疗效, 不仅能缓解患者各种临床症状, 改善各种生化免疫学指标, 还能有效防止肝性脑病、多脏器功能衰竭等并发症的发生。还可以有效改善便秘患者肠道症状［9］, 真正起到“四季脾旺不受邪”的效果。而肝脾舒对肝硬化患者的肠道粘膜是否有保护作用其机制如何尚未可知, 本研究旨在从大鼠的肠道粘膜屏障这一角度入手, 探讨肝脾舒对硬化肝的保护机制。

肝脾舒君药虎杖, 主要有效成分为虎杖苷和白藜芦醇和大黄素等。研究显示, 虎杖提取物有抗内毒素作用［10］；白藜芦醇［11］在重症急性胰腺炎的发生中具有抗氧化作用 , 能抑制TNF-α的产生 , 抑制ICAM-1和VCAM-1的表达 , 大黄素可以促进肠道平滑肌的蠕动并能抗菌抗病毒, 从而发挥肠黏膜屏障的保护作用。由此, 对此方进行进一步的临床和实验研究, 势在必行, 也是一件利国利民的好事。

本研究模型组肝脏的病理变化表明其肝脏已经形成了肝硬化。 模型组大鼠血浆内毒素水平较正常组显著升高,说明模型组形成了IETM。而肝脾舒组与杜秘克组肝脏的病理变化较模型组均有不同程度减轻, 血浆内毒素水平也降低, 经统计, 肝脾舒组对血浆内毒素水平的降低有作用明显(P＜0.05), 而杜秘克组血浆内毒素水平与模型组相比, 虽有所降低, 但差异无统计学意义(P＞0.05)。

肝脏受到损伤时肝脏Kupffer细胞功能减退, 肠道菌群失衡, 肠黏膜屏障损伤不能有效地阻止肠源性内毒素进入门静脉, 肠道细菌及内毒素易位形成IETM, 加重肝损伤。本研究模型组大鼠回肠组织病理改变表明其肠黏膜机械屏障受到损伤, 而肝脾舒组和杜秘克组回肠组织的病理变化较模型组均有不同程度减轻。说明肝脾舒和杜秘克均能够有效保护肠黏膜屏障, 但在对肝细胞的保护作用和内毒素血症的改善方面, 肝脾舒组作用优于杜秘克组。

综上所述, 肝脾舒对肝硬化大鼠肠粘膜屏障具有保护作用,这可能是其减轻大鼠肝硬化程度、延缓肝硬化进展的机制之一。

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10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.09.212

2014-11-04］

200071 上海市中医院消化科

潘相学