丹参水提物对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用

张东涛 黄伟哲 陈喜珊

丹参水提物对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用

张东涛 黄伟哲 陈喜珊

目的 观察丹参水提物对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法 采用大鼠离体心脏灌流技术制备心脏缺血再灌注损伤模型, 用不同浓度丹参水提物灌流心脏。观察记录复灌50 min时的心肌功能变化。结果 丹参水提物可提高心脏缺血再灌期的左心室舒张压(LVDP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)水平, 差异具有统计学意义(P＜0.01), 降低左心室舒张末压(LVEDP)、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)水平, 差异具有统计学意义(P＜0.01), 提高心肌中p-Akt水平, 差异具有统计学意义(P＜0.01)。结论 丹参水提物对缺血再灌注损伤心脏具有保护作用, 这一保护作用与它调节磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路有关。

离体心脏缺血再灌注；丹参水提物；磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶

丹参, 唇形科植物丹参的根。临床上丹参广泛应用于心血管系统疾病, 具有改善微循环、抗菌等作用［1］。心肌缺血再灌注损伤主要包括四个方面的病理生理学改变：再灌注性心律失常, 心肌收缩功能障碍, 心肌细胞坏死以及冠状微循环障碍［2］。本研究采用阻断离体大鼠心脏冠脉血流45 min后复灌, 模拟缺血再灌注损伤模型, 从心肌酶的漏出及心肌细胞凋亡检查等方面观察丹参水提物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 丹参水提物是作者试验室自制。

1.2 模型制备 大鼠腹腔注射(i.p.)肝素100 U/kg 抗凝, 30 min后i.p.戊巴比妥钠 50 mg/kg麻醉。快速取下心脏放于改良的K-H缓冲液(4℃)中冲洗, 迅速主动脉插管悬挂心脏于Langendorff灌流装置上, 用改良的K-H缓冲液(以95%O2和5% CO2饱和)行主动脉逆行灌流［灌注压为70 cm H2O(1 cm H2O =0.098 kPa), 速度5～8 ml/min］, 温度稳定在37℃, 自制铜电极置于心脏表面的左上及右下角, 连接Medlab生物信号处理系统记录心外膜电图。灌注液及心脏周围温度用恒温循环水浴维持在(37±5)℃。平衡灌注20 min, 待心脏各项功能稳定,关闭灌流液停止灌流, 造成全心缺血, 30 min后打开灌流液再复灌50 min。

1.3 分组与灌流方案 将大鼠分为空白对照组、I/R模型组、丹参水提物组、LY294002组, 每组 12只, 临用前将丹参水提物或LY294002溶于灌流液中, 使终质量浓度为0.15 g/L或20 μmol/L, 空白对照组用K-H液持续灌注100 min；模型组以K-H液灌流稳定20 min后, 停止灌流30 min, 复灌50 min；丹参水提物组和LY294002组复灌K-H 液中含丹参水提物或LY294002, 其他同I/R组。

1.4 LVDP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax测定 LVDP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的测定参照参考文献［3］相关内容操作。1.5 CK和LDH分析 心脏再灌流出液CK和LDH水平使用试剂盒测定。

1.6 TUNEL法检测凋亡 试剂为美国CHEMICON公司产品。组织切片常规脱蜡至水, 0.3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性, 0.1 mg/ml蛋白酶K消化40 min, TdT反应液,链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SP-HRP)37℃各作用1 h, 二氨基联苯胺(DAB)显色, 苏木素复染, 脱水, 透明, 封片。实验设加脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DnaseⅠ)的为阳性对照, 加不含TdT反应液的为阴性对照。普通光学显微镜随机选5个高倍视野(×400), 计数其中凋亡细胞数, 并算出凋亡细胞占肿瘤细胞总数的百分比值, 即凋亡指数(AI)。

1.7 Western blot实验 提取心脏组织蛋白, 经 BCA法测定蛋白质浓度, 煮沸变性, 4%浓缩胶, 12%分离胶, 上样, 电泳, 转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上, 脱脂牛奶封闭过夜, 一抗p-Akt(1：300)室温孵育2 h, 辣根过氧酶标记的二抗于室温2 h孵育, 洗涤, ECL发光显色, 曝光显影, Image J分析软件进行分析, 将目的蛋白与β-actin 光密度比值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.8 统计学方法 应用SPSS11.5统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差表示, 采用方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 同对照组相比, I/R组LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平显著降低, 而LVEDP显著增加, 差异具有统计学意义(P＜0.01)；同I/R组比较, 丹参水提物能够显著提高LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平, 降低LVEDP水平, 差异具有统计学意义(P＜0.01)。LY294002能够降低丹参水提物的作用效果,差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。见表1。

2.2 同对照组相比, I/R组CK和LDH水平显著增加, 差异具有统计学意义(P＜0.01)；同I/R组比较, 丹参水提物能够显著降低CK和LDH水平, 差异具有统计学意义(P＜0.01), LY294002能够降低丹参水提物的作用效果, 差异具有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

2.3 同对照组相比, I/R组AI显著增加, 而p-Akt蛋白表达水平显著降低, 差异具有统计学意义(P＜0.01)；同I/R组比较,丹参水提物能够显著提高p-Akt蛋白表达水平, 降低AI水平,差异具有统计学意义(P＜0.01)。LY294002能够降低丹参水提物的作用效果, 差异具有统计学意义(P＜0.01)。见表3。

表1 四组LVDP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平变化n=12)

表1 四组LVDP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平变化n=12)

注：与对照组比较,aP＜0.01；与I/R组比较,bP＜0.01；与I/R+丹参水提物组比较,cP＜0.05,dP＜0.01；1 mm Hg=0.133 kPa

组别LVDP(mm Hg)LVEDP(mm Hg)+dp/dtmax(mm Hg/s)-dp/dtmax(mm Hg/s)对照组122.5±13.62 9.04±1.154518.4±472.6-2617.3±319.7 I/R组 80.7±9.07a38.19±4.27a3281.5±351.4a-1274.1±131.6aI/R+丹参水提物组 114.2±13.11b15.37±1.66b4208.4±442.7b-2283.5±247.5bI/R+丹参水提物+LY294002组 96.3±10.42c29.41±3.28d3714.6±381.5d-1537.7±160.3d

表2 四组CK和LDH水平变化( x-±s, n=12)

表3 四组AI 和p-Akt水平变化( x-±s, n=12)

3 讨论

动物离体心脏模拟缺血-再灌注过程, 同样证实了再灌注过程诱导了心肌细胞凋亡［4］, 细胞凋亡是不同于细胞坏死的另一种细胞死亡方式, 它是在诱导因子作用下, 细胞启动内部自身基因调控机制, 引起细胞主动的自杀过程, 它涉及一系列基因的激活、表达及调控等过程［5］。本试验发现丹参水提物能够提高LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平, 降低LVEDP水平, 这表明丹参水提物能改善离体心脏的收缩功能,同时, 丹参水提物能降低心肌组织中CK和LDH的渗漏。

PI3K/Akt是细胞内重要的信号转导通路, 在细胞的凋亡、存活以及增值等活动中发挥重要的生物学功能。PI3K下游有多种效应分子, Akt处于这一通路的中心环节, 不仅是PI3K下游的直接靶点, 也是其最主要的靶酶, 传递由PI3K始动的信息。Akt的磷酸化是PI3K/Akt信号通路活化, 发挥抗凋亡作用的关键［6］。激活的Akt通过磷酸化其下游靶点,发挥抑制凋亡或促进增殖等效应保护心肌。本试验发现丹参水提物能够提高Akt的磷酸化水平, 降低心肌细胞凋亡率, Akt的抑制剂LY294002能够减弱丹参水提物的作用功效, 这表明丹参水提物能通过激活PI3K/Akt信号通路来改善离体心脏的收缩功能和降低心肌细胞的凋亡率。

［1］ Fong CC, Wei F, Chen F, et al.Danshen-Gegen decoction exerts proliferative effect on rat cardiac myoblasts H9c2 via MAPK and insulin pathways.Journal of Ethnopharmacology, 2011, 138(1):60-66.

［2］ 徐叔云, 卞如濂, 陈修.药理实验方法学.北京:人民卫生出版社, 1991:986-987.

［3］ Koyama T, Tawa M, Yamagishi N, et al.Role of superoxide production in post-ischemic cardiac dysfunction and norepinephrine overflow in rat hearts. European Journal of Pharmacology, 2013, 711(1-3):36-41.

［4］ Ventura C, Spurgeon H, Lakatta EG, et al.Kappa an d delta opioid receptor stimulation affects cardiac myocyte function andrelease from an intracellular pool in myocytes and neurons.Circ Res, 1992, 70(1):66-81.

［5］ Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR.Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics .Br J Cancer, 1972, 26(4):239-257.

［6］ Cantley LC.Thephosphoinositide3-kinasepathway.Science, 2002, 296(11):1655-1657.

Protective effect of Salvia Miltiorrhiza aqueous extract for mice isolated heart ischemia reperfusion

ZHANG Dong-tao, HUANG Wei-zhe, CHEN Xi-shan.Department of Cardiovascular Medicine, The First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China

Objective To observe the protective effect of Salvia Miltiorrhiza aqueous extract for mice isolated heart ischemia reperfusion.Methods Perfusion technique of isolated heart was applied to make isolated heartischemia reperfusion model, and different concentrations of Salvia Miltiorrhiza aqueous extracts were used for reperfusion.Records were made on the changes of myocardial function at 50 min of reperfusion.Results Salvia Miltiorrhiza aqueous extract could improve levels of LVDP, left heart interior maximum pressure rise rate (+dp/dtmax), left heart indoor pressure maximum decline rate (-dp/dtmax) during heart ischemia reperfusion, and the difference had statistical significance (P＜0.01).Levels of LVEDP, CK, and LDH could be reduced, and the difference had statistical significance (P＜0.01).Level of p-Akt in myocardium could also be improved, and the difference had statistical significance (P＜0.01).Conclusion Salvia Miltiorrhiza aqueous extract provides protective effect for isolated heart ischemia reperfusion, and its effect is related with its regulation of PI3K/ Aktsignal channel.

Isolated heart ischemia reperfusion; Salvia Miltiorrhiza aqueous extract; PI3K/Akt

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.10.004

2014-11-05］

515041 汕头大学医学院第一附属医院心血管内科(张东涛), 心胸外科(黄伟哲)；汕头大学医学院第二附属医院心血管外科(陈喜珊)