盐生植物翅碱蓬黄酮类物质及其抗氧化活性研究

李岩，张亚卓，郭璐，王宇，王向红

（河北农业大学食品科技学院，河北省农产品加工工程技术研究中心，河北保定071001）

在200多年前，人们就注意到植物中还存在一类耐盐植物—盐生植物。盐生植物是一类隐域性植物，它的生长繁殖生境就是盐渍土壤，因此，哪里有盐渍土壤，哪里就有盐生植物[1]。我国盐生植物资源非常丰富，它的种类约占世界盐生植物种类的三分之一，其中有许多种类具有重要的经济价值。翅碱蓬属于黎科碱蓬属，又名黄蓿菜、黄须菜、皇席菜、碱蓬草、黄茎菜、碱蓬、碱蓬棵等[2]，为一年生的草本植物，高20 cm～80 cm，绿色，晚秋变红紫色。翅碱蓬在我国分布的面积很广，遍布北方沿海各地，生于盐碱土、碱斑地、泥滩及泥滩附近路边草丛。翅碱蓬幼芽具有开胃、刺激食欲的作用，但是，对其营养成分的研究确鲜有报道，特别是对其黄酮类化合物的研究也鲜有报道。

黄酮类化合物是一种广泛存在于自然界中的多酚类化合物，它们不仅数量繁多、种类多样，而且结构类型复杂。近年来的研究证明，黄酮类化合物能够防治呼吸系统的疾病，防治血管硬化，具有降低血糖、抗癌、抗肿瘤以及提高免疫能力等功能，还有许多的黄酮类化合物被证明具有抗HIV病毒活性的重要功能[3]。研究发现，黄酮类化合物有可能是除了VC类和胡萝卜素类以外的另一类重要的天然强抗氧化剂[4-5]。因此，对于黄酮类化合物抗氧化活性的研究必然成为今后的研究重点。自由基的清除能力是评价抗氧化性能的一个重要指标[6]。

本研究拟采用超声波辅助萃取法提取翅碱蓬中黄酮类物质，对不同生长时期翅碱蓬黄酮的含量变化进行研究，并对翅碱蓬在不同生长时期内黄酮类物质对 DPPH·、OH·、ABTS·+的清除作用进行初步分析，以期对滩涂盐生植物翅碱蓬的开发利用提供理论参考。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

翅碱蓬：2012年采于河北沧州地区；石油醚（60℃～90℃）：天津市华东试剂；芦丁对照品（≥99%）：中国药品生物制品检验；无水乙醇、石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、磷酸二氢钠（分析纯）：天津市华东试剂厂；邻二氮菲（分析纯）：天津市天力化学试剂；硫酸亚铁、ABTS、双氧水（分析纯）：北京市中联化工。

1.2 仪器

BS214D分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；101-OAB电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；QE-100 g万能粉碎机：浙江屹立工贸有限公司；UV-2800H紫外分光光度计；尤尼柯仪器有限公司；XMTD-6000恒温水浴锅：北京长风仪表公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；QTSX6150型超声波清洗器：天津市瑞普电子仪器公司；TGL16M离心机：长沙易达仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 原料处理

将采集好的翅碱蓬，清洗干净后，至于45℃烘箱内烘干，取出后用粉粹机彻底粉碎并过40目筛，备用。

1.2.2 黄酮的提取

称取所得样品1 g放置于100 mL三角瓶中，加10 mL石油醚（60℃～90℃），超声辅助提取30 min，除去脂肪，挥干溶剂，加40 mL 70%甲醇，浸泡45 min，超声辅助提取20 min，提取液在4 500 r/min离心处理15 min，重复1次，合并提取液。弃去沉淀得到总黄酮提取液，放于50 mL的容量瓶中，定容。

1.2.3 总黄酮含量的测定

1.2.3.1 对照品溶液的配制

精密称取在120℃充分干燥至恒重的芦丁标准品10 mg，用95%的乙醇溶解，定容到10 mL的容量瓶中，再精确从中量取5 mL至50 mL的容量瓶中，用95%的乙醇稀释定容，得到浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。

1.2.3.2 标准曲线的配制

精密吸取芦丁标准品溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL具塞试管中，用95%乙醇加至5 mL，加人0.5 mL的5%的NaNO2溶液，混匀后，静置6 min；加人0.5 mL的10%的Al（NO3）3溶液，摇匀后，静置6 min；最后加入4%的NaOH溶液4 mL，摇匀，放置5 min～10 min。以试剂空白为对照，以标准品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，并在510 nm测定标准品的吸光值。

1.2.4 翅碱蓬提取液对DPPH·的清除作用[7-8]

DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，当有清除剂存在时，孤对电子被配对，吸光度下降。因此，通过测定吸光度下降的强弱程度来评价该物质清除自由基的能力。

DPPH·溶液的配制：精密称取50 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至250 mL，得到浓度为0.5 mmol/L的DPPH·母液，与4℃储存备用。

DPPH·使用液配制：准确量取DPPH·母液40 mL，用无水乙醇定容至100 mL。

DPPH·清除率的测定：取1.2.2所得翅碱蓬黄酮提取液，稀释为 10、20、40、60、80、100 μg/mL，取 2 mL与等体积的0.2 mol/L的DPPH·溶液加入同一试管中，摇匀。避光放置30 min。在517 nm测定其吸光度Ai。

清除率/%=（1-Ai-Aj/Ac）× 100

式中：Ai为待测液+DPPH·在517 nm测定其吸光度；Ac为无水乙醇+DPPH·在517 nm测定其吸光度；Aj为待测液+无水乙醇在517 nm测定其吸光度。

1.2.5 翅碱蓬提取液对羟自由基清除率的测定[9-10]

取1.2.2所得翅碱蓬黄酮提取液，稀释为10、20、40、60、80、100 μg/mL，取 1 mL 依次向样液中加入 2 mL磷酸盐缓冲液、2 mL邻二氮菲、2 mL硫酸亚铁溶液、1 mL浓度为0.1%双氧水，充分混匀后在532 nm处测其吸光度。

清除率/%=[（A0-A1）/（A2-A1）]×100

式中：A1为70%乙醇代替样液所测的吸光度；A2为用70%乙醇替代H2O2所测的吸光度。

1.2.6 翅碱蓬提取液对ABTS+·清除率的测定[11-12]

准备称取100 mg过硫酸钾于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，得到2.6 mmol/mL过硫酸钾溶液；准确称取203 mg ABTS于50 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，得到7.4 mmol/mL的ABTS溶液。将上述两种溶液混合，室温避光静置24 h，为ABTS+·储备液。在4℃避光储存。临用前用无水乙醇稀释，使其在734 nm处吸光值为 0.7±0.02，即为 ABTS+·工作液。

取1.2.2所得翅碱蓬黄酮提取液，稀释为10、20、40、60、80、100 μg/mL，取 1 mL 再加入 4 mL 的 ABTS+·工作液，立即混匀，避光，室温下静置10 min。以5 mL无水乙醇为空白，在734 nm波长下测量其吸光度值。

清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0× 100

式中：A0为无水乙醇代替样品液的吸光度；A2为蒸馏水代替H2O2的空白对照吸光度；A1为样品的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 翅碱蓬黄酮类化合物浓度测定的结果

在510 nm处测得各标准品的吸光度值，线性回归后，得标准溶液与吸光度的线性曲线为：y=11.443x+0.000 3，R2=0.999 9。

图1 芦丁溶液的标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

根据标准曲线的回归方程计算翅碱蓬在不同生长时期的总黄酮含量。

为了考察河北沧州地区翅碱蓬黄酮资源，本研究对翅碱蓬在不同生长时期的黄酮含量进行了比较和分析，结果见图2。

图2 翅碱蓬在不同生长时期的总黄酮含量Fig.2 Total flavonoid contents of saline seepweed leaves

试验结果表明，翅碱蓬的总黄酮含量在6.7851mg/g～14.47 mg/g之间。其中花期总黄酮含量差异较明显。在3个生长期内，翅碱蓬花期的总黄酮含量最高。其含量约为发芽期和展叶期的2倍。因此，在以后对翅碱蓬黄酮资源的开发与利用方面，可以尽量选择处在花期的翅碱蓬。

2.2 翅碱蓬黄酮对DPPH·的清除作用

DPPH·自由基清除能力被广泛用于评价天然产物抗氧化能力[13]。翅碱蓬黄酮对DPPH·的清除作用结果见图3。

图3 翅碱蓬黄酮对DPPH·的清除作用Fig.3 DPPH radical scavenging activity of total flavonoids extract from saline seepweed leaves

由图3可以看出，在不同生长时期的翅碱蓬黄酮提取液对DPPH·均具有一定的清除作用，并且，清除能力具有相似的变化趋势，即在一定的范围内，随着黄酮浓度的增加，翅碱蓬黄酮提取液清除能力增强。在10 μg/mL～60 μg/mL变化比较明显。翅碱蓬在花期的总黄酮提取液对DPPH·的清除率明显高于其在发芽期和生长期的清除率。翅碱蓬在花期的最大清除率为94.37%，随后逐渐降低：发芽期和展叶期均在80 μg/mL到达最大，分别为82.44%、78.94%。

2.3 翅碱蓬黄酮对OH·的清除作用

羟自由基被认为是一种影响疾病与加速衰老的最直接的自由基，它可以引发机体内组织细胞病变[14]。翅碱蓬总黄酮提取液对OH·的清除作用见图4。

图4 翅碱蓬黄酮对OH·的清除作用Fig.4 The·OH radical scavenging ability of total flavonoids extract from saline seepweed leaves

由图4可以看出，在不同生长时期的翅碱蓬黄酮提取液对OH·均具有一定的清除作用，并且，清除能力具有相似的变化趋势。在一定的浓度范围内，随着黄酮浓度的增加，翅碱蓬总黄酮提取液对OH·的清除作用增大，在 10 μg/mL～60 μg/mL 的范围内，变化比较明显。翅碱蓬在花期的总黄酮提取液对OH·的清除作用要大于在发芽期和展叶期的清除作用，在60 ug/mL达到最大的清除率，为84.21%。而发芽期和展叶期的总黄酮提取液均在80 ug/mL达到最大的清除率，分别为82.30%和72.45%。

2.4 翅碱蓬黄酮对ABTS+·的清除作用

ABTS+·自由基经常被用于测量天然产物的总抗氧化能力[15]。翅碱蓬总黄酮提取液对ABTS+·的清除作用见图5。

图5 翅碱蓬黄酮对ABTS+的清除作用Fig.5 The ABTS radical scavenging ability of total flavonoids extract from saline seepweed leaves

由图5可知，在不同生长时期的翅碱蓬黄酮提取液对ABTS+·均具有一定的清除作用，并且，在一定的浓度范围内，随着黄酮浓度的增加，翅碱蓬总黄酮提取液对 ABTS+·的清除作用增大，在 0 μg/mL～60 μg/mL的范围内，变化比较明显。翅碱蓬在花期的总黄酮提取液对ABTS+·的清除作用要大于在发芽期和展叶期的清除作用，在40 μg/mL达到最大的清除率，为93.30%。而发芽期和展叶期的总黄酮提取液均在60 μg/mL达到最大的清除率，为80.4%和82.35%。

3 结论

试验结果表明，在一定范围内，翅碱蓬黄酮的含量越高，抗氧化活性就越强。抗氧化活性的不同有可能与翅碱蓬中所含有的黄酮的种类有关。翅碱蓬在不同生长时期的黄酮提取液在60 μg/mL时，都具有较强的清除 DPPH·，OH·，ABTS+·的能力。但是，其抗氧化能力的强弱并不相同，这可能表示翅碱蓬在不同生长时期内所含有的黄酮类化合物的种类或者是所含有的黄酮类化合物组分的比例不同。清除能力较强的生长时期有可能是由于含有较高的抗氧化能力的黄酮类物质，而翅碱蓬在不同生长时期黄酮类化合物的种类及抗氧化活性的变化有待进一步研究。

翅碱蓬在沿海滩涂广泛存在，并且具有较强的抗氧化性。因此，翅碱蓬黄酮是一种很有开发潜力的天然抗氧化剂，具有广泛的开发和利用价值。

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