罗格列酮抑制TLR-4/NF-κB信号通路对肠缺血再灌注损伤的影响

刘启胜，程正位

0 引言

肠缺血再灌注损伤是临床上常见的危重事件，常伴发于腹部外伤、失血性休克、肠移植、严重创伤、感染、烧伤等病理和手术状态下［1-2］。其发病机制包括炎症、凋亡、坏死等，但其具体机制目前依然不清楚［3-4］。PPAR-γ激动剂罗格列酮因其卓越的降糖作用而被广泛用于临床，最近研究发现，其不但有降糖作用，还具有明显的抗炎作用［4-5］，而炎症是肠缺血再灌注损伤的重要发病机制［6-8］。本实验利用大鼠肠系膜上动脉(SMA)夹闭模型，研究静脉注射罗格列酮对肠道缺血再灌注损伤后的作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器和动物 罗格列酮(Sigma，USA)，水合氯醛(Google生物)。TLR-4(CST，USA)，p-p65(CST，USA)，p65(CST，USA)，PPAR-γ(CST，USA)，p-PPAR-γ(CST，USAP)，βactin(abgent，USA)，TRIzol reagent(Invitrogen，USA)，逆转录试剂盒(GeneCopoeia，USA)，SYBR green(Takara，Japan)，qPCR 引物(擎科生物技术有限公司，序列见表1)，ELISA试剂盒购自于eB-science，HE试剂由温州医科大学第一附属医院病理实验室配制。紫外分光光度计(Thermo fisher)，逆转录仪(eppendorf)，qPCR仪(BIO-RAD IQ5)，显微镜(Olympus BX51)及成像系统(HITMAS-30)均由四川省人民医院病理科提供。SD大鼠，SPF级，北京华富康动物实验中心。

1.2 动物模型的建立与分组 30只健康雄性SD大鼠，2月龄，平均体重220～250 g，合格证编号:103079。适应性喂养1周后，状态良好，按体重随机分为假手术组(Sham组)、肠缺血再灌注损伤组(IRI组)和罗格列酮预处理组(RGZ组)，每组10只。RGZ组术前1 h给予罗格列酮静脉注射(0.3 mg/kg)，剂量参考文献［9］。Sham 组和 IRI组给予等体积静脉注射生理盐水;Sham组行假手术，IRI组和RGZ组行小肠缺血再灌注损伤手术。具体手术方式如下:大鼠在腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉状态下，行腹部正中切口，钝性分离肠系膜上动脉根部(SMA)，用微血管夹夹闭SMA根部，完全阻断血流45 min后松开血管夹，恢复肠道血流形成再灌注。缝合腹部，再灌注4 h后处死大鼠，收集标本。Sham组操作同上，但开腹后不夹闭肠系膜上动脉。

表1 实时定量PCR检测的引物序列

1.3 肠道组织学检查 小肠组织切片经10%中性甲醛固定、石蜡包埋、PAS染色之后，在光镜下观察小肠组织病理学变化。小肠损伤程度用Cuzzocrea等［9］报道的积分法评估。0分为正常绒毛和腺体;1分为部分绒毛顶部上皮轻度受损;2分为上皮下腺体轻度受损;3分为上皮下间隙扩大，毛细血管充血;4分为上皮与固有层中度分离，腺体受损;5分为部分绒毛顶部脱落;6分为绒毛脱落明显，毛细血管扩张;7分为固有层绒毛脱落，腺体受损明显;8分为固有层开始消化分解;9分为出血、溃疡。

1.4 Western印迹检测 取小肠组织于精微天平称重，按照每50 mg组织中加入1 mL RIPA裂解液，冰上匀浆，裂解30 min后，4℃ 12 000 r/min离心30 min后取上清，BCA法测定蛋白浓度。以含50 μg蛋白质的上样量，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，后转膜，然后洗膜，以5%脱脂奶粉(TBST配制)封闭1 h，PPAR-γ(1∶1 000)、p-PPAR-γ(1∶500)、p65(1∶1 000)、pp65(1∶1 000)、TLR-4(1∶500)、β-actin(1∶3 000)单抗孵育过夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗)37℃孵育1 h。洗膜后加ECL试剂，Kodak化学发光仪曝光显示目的蛋白，并拍照。以Quantity one对条带进行定量分析，以目的条带和β-actin条带积分灰度值比值作为结果。

1.5 实时定量 PCR(RT-PCR)检测 IL-6、TNF-α和IFN-γ 称取适量小肠组织，于液氮中研磨成粉末状提取总RNA，紫外分光光度计测量浓度，逆转录以及扩增反应按试剂盒说明书进行。以管家基因β-actin作为内参对照基因，用得到的各样本的Ct值按公式2－ΔΔCT计算相对表达量。

1.6 ELISA检测血清IL-6、TNF-α和IFN-γ表达水平 按照ELISA试剂盒说明书操作步骤检测血清中 IL-6、TNF-α 和 IFN-γ表达水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件包进行资料分析，实验结果采用±s表示，资料采用单因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 促红细胞生成素预处理对缺血再灌注损伤小肠组织结构的影响 光镜下观察肠道组织病理学变化，可见Sham组肠道黏膜细胞排列基本整齐，结构完整，无组织坏死、缺失及水肿。肠缺血再灌注组可见小肠黏膜上皮下间隙扩大，腺体受损及毛细血管充血、水肿，肠道组织有大量绒毛脱落、糜烂、炎性细胞浸润、肠道组织结构破坏。罗格列酮预处理治疗可以减轻缺血再灌注损伤导致的病理损伤。各组小肠缺血再灌注损伤程度见图1。

2.2 RGZ预处理对 PPAR-γ激活的影响 与Sham组比较，IRI组 p-PPAR-γ表达明显增高(P＜0.01)，但 PPAR-γ表达无明显差异(P＞0.05)。与IRI组比较，经RGZ预处理的RGZ组p-PPAR-γ表达进一步升高(P＜0.05)。见图2。

2.3 RGZ预处理对TLR-4激活的作用 与Sham组比较，IRI组TLR-4表达明显增高(P＜0.001)，与IRI组比较，RGZ组TLR-4表达明显减低(P＜0.05)。见图3。

图1 RGZ预处理对肠缺血再灌注损伤导致的肠组织病理改变的影响(10只/组)(400×)注:与 IRI组比较，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

图2 RGZ预处理对PPAR-γ蛋白表达的影响(10只/组)注:与 IRI组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

2.4 RGZ预处理对NF-κB的影响 与Sham组比较，IRI组p-p65表达明显增高(P＜0.001)，但p65表达无明显差异(P＞0.05)。与IRI组比较，经RGZ预处理的RGZ组，p-p65表达明显减低(P＜0.05)。但p65表达依然无明显差异(P＞0.05)。见图4。

2.5 RGZ预处理对促炎症因子TNF-α、IFN-γ和IL-6表达的影响 炎症因子是调节炎症反应的重要影响因素。实时定量PCR检测显示，IRI组与Sham 组比较，TNF-α、IFN-γ和IL-6mRNA表达水平明显增高(P＜0.001)，RGZ组与Sham组比较，TNF-α、IFN-γ 和 IL-6 mRNA 表达水平明显降低(10只/组)(P＜0.05)。见图5。

图3 RGZ预处理对TLR-4蛋白表达的影响(10只/组)注:与 IRI组比较，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

2.6 RGZ预处理对TNF-α、IFN-γ和IL-6分泌的影响 ELISA检测显示，与 IRI组比较，IRI组TNF-α、IFN-γ 和 IL-6 分泌明显增高(P ＜0.001)，与 Sham 组比较，RGZ 组 TNF-α、IFN-γ 和 IL-6 mRNA分泌明显降低(P＜0.05)，见图6。

图4 RGZ预处理对p65蛋白表达的影响(10只/组)注:与 IRI组比较，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

图5 RGZ预处理对TNF-α(A)、IL-6(B)和IFN-γ(C)mRNA表达的影响(10只/组)注:与 IRI组比较，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

图6 RGZ 预处理对 TNF-α(A)、IL-6(B)和 IFN-γ(C)的影响(10 只/组)注:与 IRI组比较，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

3 讨论

肠缺血再灌注损伤是肠道缺血后恢复血液循环难以避免的一种损伤，好发于肠移植、休克、肠梗阻等疾病，常导致非常严重的后果［1-3］。其发病机制包括炎症、凋亡、坏死等，但具体机制目前依然不明［6-8］。

近年来的研究表明，炎症在肠I/R的发病过程中起重要的作用［6］。肠I/R可显著提高内毒素攻击的敏感性、可使机体单核/巨噬细胞、中性粒细胞处于致敏状态。激发机体产生和释放各种细胞因子及炎性介质，使细胞因子网络平衡，从而引发SIRS、甚至MODS［6］。因此，削弱炎症是减轻肠缺血再灌注损伤的有效途径之一。

TLR-4/NF-κB介导的炎症信号通路在肠缺血再灌注损伤发挥重要作用［10］。NF-κB激活取决于其亚单位p65的激活［11］。罗格列酮为过氧化物酶增殖酶受体(PPAR-γ)激动剂之一，因其具有广泛的降糖作用而广泛用于临床［4-5］。最近研究发现，PPAR-γ 激活可以调节 TLR-4/NF-κB 信号通路［12］。

实验结果显示，肠缺血再灌注损伤可引起肠道充血、水肿、出血、坏死，肠腔内可见糜烂、出血及溃疡，肠腺上皮细胞水肿、坏死脱落。罗格列酮预处理能明显减轻上述症状，减轻IRI导致的肠道病理变化，对肠道机械屏障也具有明显的保护作用。研究发现，肠 I/R 后，TNF-α、IL-6、IFN-γ 等促炎症细胞因子均明显升高;罗格列酮预处理可明显抑制 I/R 导致的 TNF-α、IL-6、IFN-γ促炎症因子表达水平升高，提示罗格列酮可抑制促进抗炎因子的释放，控制持续扩大的炎症反应，防止肠黏膜局部及全身组织器官损伤，从而达到防治肠缺血再灌注损伤的目的。对罗格列酮在肠I/R抑制促炎症细胞因子表达的机制研究显示，罗格列酮预处理通过进一步激活PPAR-γ，可以抑制肠I/R导致的TLR-4/NF-κB信号通路的激活。

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