Jagged1蛋白在早期自然流产患者绒毛组织中表达的研究

王晨曦，林其德

导致自然流产的根本原因之一可能是滋养细胞的缺血、缺氧及血管重铸障碍。笔者在前期研究中发现，母胎界面Notch受体(Notch1－4)的异常表达可能诱导自然流产的发生［1－2］。Notch1/Jagged1 在晚期妊娠子痫前期胎盘组织中表达下调［3］，可能在早期就影响滋养细胞的分化、浸润、绒毛胎盘的血管形成，故本研究进一步检测了Jagged1在早期自然流产患者绒毛组织中的表达，以了解Jagged1蛋白是否参与自然流产的发生发展过程。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2011年12月至2013年2月在解放军第四一一医院计划生育门诊就诊的患者，经患者知情同意及医院伦理委员会同意行绒毛标本采集。15例自然流产患者为自然流产组，平均年龄(28.2±1.93)岁，平均孕周(7.06±1.58)周，B超显示无胚芽或无胎心搏动伴阴道流血;20例正常早期妊娠患者为正常妊娠组，自愿要求中止妊娠，平均年龄(26.12±2.58)岁，平均孕周(7.03±1.02)周，B超显示有胚胎心血管博动，无不良妊娠史。2组患者的年龄和孕周比较差异均无统计学差异(P＞0.05)。

1.2 方法 (1)标本采集:无菌采集上述2组的离体绒毛，PBS洗净血液，一半用4%多聚甲醛固定24～48 h后，常规石蜡包埋;另一半放入焦炭酸二乙酯(DEPC)处理的冷冻管中，置－80℃冰箱保存，用于RNA抽提和蛋白质提取。(2)引物与探针:根据Gene Bank提供的Jagged1和GAPDH基因mRNA序列，采用ABI Primer 5.0软件设计引物和TAMRA探针，由上海英骏生物技术有限公司和上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见文献［3］。(3)实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(rea1－time RT－PCR):按照RNA抽提试剂盒和cDNA逆转录试剂盒(购自Invitrogen和Toyobo Biotech公司)说明进行 RNA抽提和 cDNA合成［3］。(4)免疫印迹法检测(Western－b1ot):取冻存管中绒毛组织约100 mg，加入 200 ～1 000 μ1总蛋白抽提液，严格按照蛋白免疫印迹操作步骤进行。使用标准曲线计算未知样品蛋白的相对含量［3］。

1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件，结果以均数±标准差(x±s)表示，组间差异比较采用F检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 自然流产组与正常妊娠组绒毛Jagged1蛋白的免疫定位 妊娠早期Jagged1蛋白主要在细胞滋养细胞的细胞浆中表达。在自然流产组绒毛组织中呈弱阳性表达，较正常妊娠组略减弱。见图1。

注:A为正常妊娠组;B为自然流产组

1 2组患者绒毛组织Jagged1蛋白的免疫定位(HE染色)

2.2 自然流产组与正常妊娠组绒毛Jagged1mRNA的表达 Rea1－time PCR结果以2－ΔΔCt比值来表示。正常妊娠组绒毛组织中 Jagged1mRNA的2－ΔΔCt水平为(0.0623±0.0007)，明显高于自然流产组的(0.0315±0.0065)，约为自然流产组的1.97倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 自然流产组与正常妊娠组绒毛Jagged1蛋白的表达 2组绒毛组织中Jagged1蛋白的表达，以目的蛋白条带与β－actin条带吸光度相对比值表示样本的相对含量。Western－b1ot分析显示，正常妊娠组绒毛组织中Jagged1表达水平为0.67±0.24，自然流产组为0.59±0.18，2组差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

妊娠早期滋养细胞适时、适量增殖、分化、迁移、浸润、凋亡是胚胎着床和胎盘形成的关键，母胎界面滋养细胞浸润子宫内膜的过程类似于恶性肿瘤的侵袭，这一过程受滋养细胞和局部微环境的精细调节，从而达到动态平衡。Notch受体或配体蛋白的激活可能启动滋养细胞和血管内皮细胞之间的“对话”，促母胎界面新生血管形成。Notch受体与邻近细胞表面的配体结合后，可激活Notch信号通路。在大多数对恶性肿瘤的研究［4－6］中都表现为 Notch受体和配体分子表达失调以及Notch信号的异常激活。Jagged1参与调控许多组织的生长发育，在造血、肌肉形成、神经和血管发生等过程中起重要作用。研究显示［7－8］，Jagged1 在肿瘤组织中多呈高表达，提示与恶性肿瘤侵袭性增强、预后不良有关，可作为肿瘤侵袭、转移的重要指标。

Jagged1是哺乳动物组织中第一个被证实的Notch受体的配体，通过与邻近细胞表面Notch的细胞外结构域结合而触发Notch信号通路，为单次跨膜糖蛋白，属于 DSL(De1ta，Serrate，Lag－2)蛋白家族，胞外区具有2个保守序列，即1个富含半胱氨酸的区域(systeine－rich，CR)也就是结合Notch受体所必需的DSL基序，和16个表皮生长因子(epiderma1 growth factor，EGF)样重复区。人类Jagged1基因定位于染色体20p12，全长5.94 kb，ORF编码3 657个氨基酸，与大鼠Jagged1的胞外区有98%的同源性。在早期胚胎发育的血管形成中，Notch基因起着关键性的作用，Jagged1可引发附近血管细胞中Notch的活化并促进新生血管的形成，可能作为癌基因影响细胞的浸润能力和抑制新生血管的发生［9－10］。小鼠Jagged1突变引起血管发育缺陷，导致胚胎死亡［11］。在临床中可见，部分自然流产患者B超提示在胚囊或胚芽阶段缺乏心管搏动出现胚胎停育，或者胚胎心管搏动从有到无，提示胚胎早期血供不足或心血管发育障碍是自然流产的病因之一。Herr［12］的研究结果显示，Jagged1在人类胎盘血管形成和分化过程中起潜在的关键性的作用。

Notch蛋白的调控异常可能造成母胎界面滋养细胞促血管样结构形成能力的受限。笔者的前期研究［1－3］结果提示，Notch 蛋白可能由于其配体和受体在母胎界面表达的异常，直接影响滋养细胞的迁移和浸润功能，阻碍了母胎界面新生血管的形成，可造成病理妊娠的发生。本研究结果显示Jagged1蛋白在自然流产绒毛组织中的表达呈下调趋势，提示Jagged1可能与血管形成障碍(血管生成减少或血管稳定性差)有关，从而造成滋养细胞和胎盘组织缺血缺氧，诱导并参与了自然流产的发生发展过程。

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