血清中胎盘来源外泌体的分离与鉴定

李玉静，刁振宇，薛平平，沈 莉，龚 萍，颜桂军，胡娅莉

0 引 言

外泌体是由细胞细胞质内的晚期内泡小体以膜融合的方式通过胞吐方式主动分泌到细胞外环境的一种直径30 ～100nm 的微型囊泡［1］，其形态规则，呈圆形或椭圆形杯状结构，不同类型细胞分泌的外泌体具有很多共性，包括膜上富含脂筏及丰富的跨膜蛋白，如四次跨膜蛋白家族成员CD63、CD81等，表面为类似于细胞膜的脂质双分子层，具有一定的疏水性。外泌体能够携带微小RNA(microRNAs，miRNAs)、RNA、蛋白质等生物活性分子，并在细胞外环境稳定存在，而且通过传递供体细胞信息，调节靶细胞的代谢通路［2］。外泌体可由多种类型细胞分泌，妊娠期母体血清中存在表达胎盘碱性磷酸酶(placental alkaline phosphatase，PLAP)的胎盘来源外泌体［3］，并且在妊娠中发挥重要的作用。

由于外泌体纯化和鉴定技术的限制，目前只能研究胎盘释放的所有微型囊泡的混合物对靶细胞的生物学功能和行为的影响［4］。这种混合物除外泌体，还包括微泡、脱落体、凋亡体等多种类型的囊泡［5］。因此难以确切阐明胎盘外泌体的生物学作用。目前随着方法学的不断进步，已建立了一些外泌体分离方法，本研究通过对现有的外泌体分离方法进行改良，以期确立高效的胎盘来源外泌体的分离方法。

1 材料与方法

1.1 实验样本 取10 例在南京鼓楼医院产科正常分娩的足月妊娠女性的血清为实验样本。于清晨空腹抽取孕妇肘外周静脉血3 mL，置于未加抗凝剂的生化管中，静置30 min，2000×g 离心5 min，吸取血清置于干试管中，-80 ℃保存备用［6］。本研究经医院伦理委员会批准，孕妇及家属同意参与并签署知情同意书。

1.2 主要材料与试剂 CD81、CCND1 抗体购自Santa Cruz 公司;CD63 抗体购自Bioworld 公司;PLAP 抗体购自BBI 公司;蛋白酶抑制剂购自Sigma 公司;有酚红(H1020)/无酚红(H1025)Hank's 液购自Thermo Fisher 公司;永生化的人妊娠早期绒毛外滋养细胞株(HTR-8/SVneo 细胞)由加拿大皇后大学Dr Charles H.Graham 馈赠;RPMI 1640 培养液、青链霉素和胎牛血清(FBS)等细胞培养试剂购自HyClone 公司。

1.3 方法

1.3.1 母血清胎盘来源外泌体的分离 取储存于-80 ℃的正常孕妇血清10 份，每份取200 μL，4 ℃下2000×g 离心30 min，取上清，0.22 μm 过滤器过滤，收集滤过液。滤过液中加入1/4 体积的40%PEG6000，混匀后4 ℃孵育过夜，4 ℃下10000×g 离心60 min，0.25 mol/L 蔗糖液悬浮沉淀，进一步蔗糖梯度离心纯化，即蔗糖联合有/无酚红Hanks 液制备蔗糖密度梯度(14%、21%、27%、34%、40%)，将各密度层溶液分层吸出，再次使用PEG6000 沉淀，PBS 重悬。

1.3.2 胎盘来源外泌体特异性蛋白分析 纯化得到的外泌体沉淀经BCA 试剂盒进行蛋白定量，10% SDS-PAGE 胶电泳分离，转印至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h［7］，分别加外泌体标志分子抗体anti-CD63(1∶1000 稀释)、anti-CD81 抗体(1∶1000稀释)及胎盘外泌体特有标记蛋白分子抗体anti-PLAP(1∶1000 稀释)，4 ℃孵育过夜，二抗室温避光孵育60 min，ECL 显影检测蔗糖密度梯度离心后各密度层的外泌体标志蛋白含量。

1.3.3 外泌体蛋白样品银染 SDS-PAGE 胶电泳后，取下胶，进行银染。固定:40%乙醇，10%冰醋酸。将凝胶板浸入固定液中，固定30 min;水洗:去离子水浸泡3×10 min;致敏:量取75 mL 乙醇，17 g乙酸钠或三水乙酸钠，0.5 g 硫代硫酸钠加去离子水到体积250 mL。将固定后的凝胶浸入致敏液中，浸泡30 min;水洗:去离子水浸泡3×10 min;银染:0.625 g AgNO3、100 μL 37%甲醛(在使用前加入)加去离子水到终体积250 mL。将胶浸入银染液中，浸泡30 min;水洗:去离子水浸泡3 次，每次20 s;显色:6.25 g Na2CO3、50 μL 37%甲醛(在使用前加入)加去离子水到终体积250 m，显色2 ～15 min，使蛋白各条带显示，将凝胶取出;终止:1 g 甘氨酸加去离子水到终体积250 mL，浸泡凝胶10 min，扫胶仪白光下摄片。

1.3.4 透射电镜鉴定母血清胎盘来源外泌体形态前固定:将外泌体沉淀用 配制的5%，4 ℃固定2 h;漂洗:用0.1 mol/L 磷酸漂洗液漂洗4 次，每次15 min;后固定:1%4 ℃固定2 h;漂洗:用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗2 次，每次15 min;快染:2%醋酸铀水溶液孵育2 h;脱水:50%丙酮孵育15 min;70%丙酮孵育15 min;90%丙酮孵育15 min;100%丙酮孵育15 min;100%丙酮孵育15 min;浸渍:100%丙酮+包埋液(1∶1)室温孵育1.5 h;100%丙酮+包埋液(1∶2)室温孵育1.5 h;纯包埋液37 ℃孵育3 h;包埋:准备标签，包埋模具;固化:60 ℃烘箱内孵育36 h;切片50 ～60 nm;3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色;透射电镜观察，拍片。

1.3.5 动态光散射(dynamic light scattering，DLS)测定外泌体粒径及分布 马尔文激光散射粒度测定仪(Malvern，Nano-ZS90 ZEN3690)是根据纳米颗粒做无规则布朗运动时，观测散射光随时间的波动性得到颗粒布朗运动的速度，并通过斯托克斯-爱因斯坦方程测定粒径及粒度分布［8］。将样品用PBS 稀释成3 ～5 个相差一个数量级的浓度，添加到样品池中，打开DTS 软件，设置温度(25 ℃)、温度平衡时间(70 s)、粘度(0.89 cP)、折射率(1.330)及测量次数，同一样本测量3 次，然后进行分析，得到样品粒径的平均值以及粒径大小的分布。

1.3.6 PKH67 荧光染料标记外泌体 PKH67 荧光细胞标记试剂可在细胞膜的脂质双分子层中稳定结合绿色荧光染料，因此常用于标记含有脂质双分子层膜的外泌体［9］。方法参照试剂盒说明书。简述如下:将分离得到的外泌体沉淀用1mL 试剂盒中稀释液C 重悬;染色前，准备4×10-6mol/L 的PKH67染液(用稀释液C 稀释)置于离心管中;尽快加外泌体到稀释后的染料中，用吸管均匀快速混合样品;室温孵育2 ～5 min，定时轻轻颠倒离心管充分混匀;加入等量1%BSA 孵育1 min 终止染色反应;为排除FBS 含有的外泌体的影响，通过超声粉碎FBS 中的外泌体［10］，用等量含超声粉碎外泌体后血清培养基稀释终止的反应液;100 000×g 离心70 min，去上清;加10 mL 超声后的完全培养基重悬外泌体沉淀，与HTR-8/SVneo 细胞共孵育6 h;荧光显微镜分析HTR-8/SVneo 细胞对外泌体的摄入情况。

2 结 果

2.1 蔗糖密度梯度联合2 次PEG6000 沉淀后各密度层蛋白情况 经SDS-PAGE 胶电泳后银染，各密度层蛋白条带，Western blot 检测各密度层外泌体标志性蛋白分子(CD63、CD81)及胎盘特异性标志分子—PLAP 的表达情况，胎盘外泌体的标志蛋白分子主要表达于21%～34%蔗糖密度层，这提示胎盘相关外泌体主要存在于1.08 ～1.10 g/mL 蔗糖密度层。见图1。

图1 蔗糖密度梯度联合2 次PEG6000 沉淀后各密度层蛋白情况Figure 1 Protein profiles in different density layers following sucrose gradient centrifugation by 8%PEG6000 precipitation twice

2.2 透射电镜鉴定胎盘外泌体形态 透射电镜鉴定蔗糖密度梯度离心联合2 次PEG6000 沉淀分离得到的血清胎盘外泌体形态，电镜视野下可见外泌体呈现典型的圆形或椭圆形杯状结构，直径为30 ～100 nm。见图2。

图2 透射电镜鉴定胎盘外泌体形态Figure 2 Transmission electron microscopy of the isolated placental exosomes

2.3 DLS 检测胎盘外泌体粒径及分布 外泌体直径大部分分布于28 ～91 nm 之间［粒径=(41.79±11.94)nm］。见图3。

图3 DLS 检测胎盘外泌体粒径及分布Figure 3 Particle size and distribution of the isolated placental exosomes measured by DLS

2.4 PKH67 标记的胎盘来源外泌体进入滋养细胞的情况 为了测定分离得到的胎盘来源外泌体是否保持进入细胞的活性，我们采用PKH67 绿色荧光染料标记血清中胎盘外泌体，观察外泌体进入HTR-8/SVneo 绒毛外滋养细胞的情况。将PKH67 标记的外泌体与HTR-8/SVneo 绒毛外滋养细胞共孵育6 h，PBS 作阴性对照，4%多聚甲醛固定细胞，核染料DAPI 染色，荧光显微镜下观察外泌体进入HTR-8/SVneo 细胞的情况，Photoshop 软件对图像进行融合，外泌体具有进入滋养细胞的活性。绿色荧光颗粒指示PKH67 标记的外泌体。见图4。

图4 PKH67 标记的胎盘来源外泌体进入滋养细胞的情况(×400)Figure 4 Fluorescent microscopy of the placental exosomes labeled by PHK67 dye uptake(×400)

3 讨 论

妊娠期间胎盘可释放外泌体到全身循环系统，参与妊娠期间母胎界面的免疫调节［11］、子宫螺旋动脉重塑［12］和胎盘屏障的形成［10］等重要事件调控，在正常妊娠过程维持中发挥重要作用。而很多妊娠并发症，如子痫前期等胎盘功能紊乱相关疾病的发生，很可能与胎盘来源外泌体异常密切相关。为进一步探究胎盘外泌体在正常妊娠及各种妊娠并发症中的作用，必须建立高效的胎盘来源外泌体分离方法。

目前外泌体分离方法主要包括:多步差速离心、蔗糖密度梯度离心、试剂盒沉淀、免疫磁珠分选、色谱法、过滤离心等方法。其中，多步差速离心是制备外泌体的经典方法［13］，该方法是根据外泌体的沉降系数差速离心将其分离出来，然而妊娠期母血清中除含有胎盘组织释放的外泌体，还包括许多其他种类细胞释放的外泌体，如树突状细胞、淋巴细胞等［14］，且血清中可能还存在一些大小类似的物质混杂其中，这些因素都会影响胎盘来源外泌体的分离纯化。目前市面上开发的外泌体提取试剂盒［15-20］，是根据外泌体表面由类似于细胞膜的脂质双分子层具有一定疏水性这一特性，用试剂捆绑水分子，从而可通过常规离心收集沉淀获取外泌体。这种快速提取外泌体的方法虽简便快捷、样本需求少、对设备要求低，但与差速离心方法类似，其分离得到的沉淀包含其他细胞分泌的囊泡，且血清中含有大量血清蛋白分子，成分复杂，很可能掺杂一些未知的疏水大分子物质。Sabapatha 等［14］曾根据来源于胎盘的外泌体表面特异表达PLAP 这一特性，使用耦合到磁珠的抗PLAP 抗体，采用磁珠分选方法分离血浆中胎盘来源外泌体。此法虽不需要进行超速离心，适于检测胎盘外泌体成分，得到的胎盘外泌体具有特异性，但可以提取的胎盘外泌体量少，不适用于大规模提取制备，且免疫磁珠价格昂贵，不利于提取技术的普及。

2013 年，Vlassov 等［21］发表的一篇外泌体的提取方法及组成的专利文献中介绍，通过终浓度为8%的PEG6000 与生物体液共孵育14 h 后，10 000×g 离心1 h，可将直径在30 ～150 nm 之间，且包含丰富RNA 的外泌体沉淀下来。因此我们采用终浓度为8%的PEG6000 沉淀血清中的外泌体，为了进一步纯化胎盘相关外泌体，我们将获得的包含外泌体的沉淀用PBS 重新悬浮后，加入非线性蔗糖密度梯度层，100 000×g 超速离心5 h，将分层液采用PEG6000 进行2 次沉淀。经过多次实验反复验证，确定同时表达外泌体标志蛋白分子及胎盘特异性蛋白分子的胎盘来源外泌体所在密度层。

本研究采用蔗糖密度梯度离心联合2 次PEG6000 沉淀，试剂价格低廉且易获得，操作方法简便，极大地降低了外泌体的提取成本，且获得的外泌体不仅表达外泌体公认的标志蛋白分子，同时也表达胎盘特异性蛋白分子，证明我们通过这种方法获得的外泌体是胎盘来源外泌体。

我们通过蔗糖密度梯度离心后得到的外泌体沉淀经蛋白质SDS-PAGE 胶电泳，银染后可见各蛋白分子条带清晰可见，动态光散射分析粒径，结果显示获得的外泌体颗粒粒径大部分分布于28 ～91 nm 之间，与文献报道外泌体颗粒大小相一致，且分布曲线呈单峰，证明所获得的外泌体颗粒粒径分布均一。且胎盘外泌体经过PKH67 荧光染料染色后，与细胞共孵育，荧光显微镜下观察外泌体具备进入细胞的活性，进一步验证了我们应用此种改良的分离方法可有效的获得胎盘来源的外泌体。

本研究通过蔗糖密度梯度离心联合2 次PEG6000 沉淀成功分离得到母体血清中胎盘来源外泌体，并从蛋白标志分子、电镜、粒径及分布、进入细胞活性四方面对其进行了鉴定，为研究妊娠期间胎盘外泌体在正常妊娠及胎盘源性并发症中的作用奠定了基础。

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