肺腺癌患者突触小体相关蛋白家族的表达研究

黄 兴，陆世民，王 欣，陈 辰，王 洁，许 林，任斌辉

0 引 言

肺癌发病率及病死率位居恶性肿瘤之首［1］。肺癌的侵袭转移是其恶性的标志和特征，也是肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因，约90%患者最终死于肺癌转移［2］。当前针对肺腺癌驱动基因表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)治疗显示了较好的临床疗效［3-5］，但肺癌总体5 年生存率依然在20%～30%［6］。因此筛选肺癌侵袭转移特异的新型分子靶标并探索其功能，是当前肺腺癌研究领域关注的热点问题。包括肿瘤细胞在内，真核细胞内的膜性细胞器之间的物质运输(如蛋白质、脂类)，主要通过囊泡完成;细胞通过囊泡运输系统完成生命活动，包括新陈代谢、命运决定、增殖分化、运动迁移及损伤修复等［7］。有研究报道，N-乙基马来酰胺-敏感因子受体(soluble NSF attachment protein receptors，SNARE)蛋白作为囊泡运输系统的核心，在基质金属蛋白酶的转运过程中起到了非常重要的作用，从而促进了肿瘤的侵袭与转移［8-9］。而可溶性N-乙基马来酰胺-敏感因子附着蛋白(synaptosome associated protein，SNAP)作为SNARE 蛋白的一种，主要参与了这一过程。SNAP蛋白家族作为SNARE 复合物的一大类，目前已知主要有SNAP23、SNAP25、SNAP29 及SNAP47 4 种蛋白，其中SNAP23 及SNAP47 是全身表达的［10-11］。但目前尚无囊泡运输系统SNARE 复合物关于非小细胞肺癌的研究。因此我们认为针对非小细胞肺癌，挖掘肺癌相关的SNAP，将有助于揭示肺癌侵袭转移的新机制，为临床诊疗提供新思路。

我们前期进行了大通量的基因芯片筛选，发现SNAP23 是正常肺组织中主要表达的SNAP 蛋白，而SNAP47 基因在肺癌组织中相对于癌旁组织的表达明显升高。通过TCGA 在线数据库(http://cancergenome.nih.gov/)下载相应肺腺癌组织及癌旁组织SNAP47 RNA seq 数据，数据表明非小细胞肺癌标本中SNAP47 mRNA 表达明显高于对应癌旁组织(P ＜0.01)。因此，本研究应用TCGA 数据库进一步筛选验证SNAP 在肺癌中的表达，并检测临床肺癌患者癌组织和癌旁组织中相应SNAP47 mRNA 的表达，探讨其与临床病理特征的关系，为进一步研究SNAP 家族基因与肺癌的发生、发展关系奠定基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集江苏省肿瘤医院2014 年5 月至2014 年9 月共52 例肺腺癌患者资料，其中男29例，女23 例;年龄≥60 岁者29 人。取患者距肿瘤边缘5 cm 处的正常组织做对照，所有癌组织标本均经病理检查明确诊断。新鲜标本取出后立即置于液氮罐内冻存，然后转入-80 ℃保存。病理分期采用肺癌研究国际联盟(IASLC)2009 年公布的TNM 分期，患者术前均未接受过放疗或化疗。患者的性别、年龄、有无胸膜侵犯、分化程度、淋巴结是否转移、临床分型分期等临床资料完整。

1.2 主要试剂和仪器 总RNA 抽提试剂Trizol Reagent 为美国Invitrogen 公司产品;Real-time 逆转录试剂盒(R0036A)为Takara 公司产品;SYBR®Select Master Mix 试剂盒和实时定量PCR 检测仪购自美国Applied Biosystems 公司。

1.3 引物 根据Genebank 公布的人SNAP23、SNAP25、SNAP29 及SNAP47 基因序列，应用引物设计软件primer5.0 设计引物，并经Genebank Blast 检索确定引物的特异性。内源性对照基因选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease，GAPDH)。引物序列:SNAP47 上游引物:GCTGTCGCTCAGGTTCAT，下游引物:CTCCCTCCAGAAATGCTC;SNAP23 上游引物:CTGGGTTTAGCCATTGAGTCTCAGG，下游引物:GGTGTCAGCCTTGTCTGTGATTCG;SNAP25 上游引物:ATGGATGAAAACCTAGAGCAGG，下游引物:ACACTTAAC CACTTCCCAGC;SNAP29 上游引物:ATGTCTGGCTATCCTAAA，下游引物:CTGGCTTGGTACTTGTT;GAPDH 上游引物:GAAGGTGAAGGTCGGAGT，下游引物:GAAGATGGTGATGGGATTTC。所有引物均由上海Invitrogen 公司合成。

1.4 方法

1.4.1 总RNA 提取及浓度测定 使用TRIzol Reagent 一步法提取肺腺癌细胞株及肺癌组织标本总RNA，操作步骤严格按照说明书。随后经紫外分光光度计确定所得到的RNA A260/A280比值在1.8 ～2.0之间，说明RNA 无蛋白污染，符合后续RT-qPCR实验要求。最后，通过A260的值计算RNA 的浓度。总RNA 提取后加入100 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC)水稀释，储存于-80 ℃备用。

1.4.2 cDNA 合成 反应体系20 μL。取1.5 μg RNA，加入4 μL 5×PrimeScriptTMRT Master Mix，然后加无RNA 酶水至20 μL。反应条件:37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃15 min 行逆转录。合成好的cDNA 置于-80 ℃保存备用。

1.4.3 实时定量逆转录-聚合酶链(real time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)反应 反应体系10 μL。2×SYBR®Green Real-time PCR Master Mix 5 μL，上游引物(5 μmoL/L)0.4 μL，下游引物(5 μmoL/L)0.4 μL，cDNA 2 μL，加DEPC水至10 μL。将反应管置于7300 Real-time PCR 反应仪(Applied Biosystem 中)，反应条件为95 ℃预变性10 min 后，按下述条件扩增40 个循环:95 ℃10 s，60 ℃1 min。每个实验重复3 次。采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量［12］，公式如下:

ΔΔCt=ΔCt-Avg.ΔCt=(CtSNAP47-CtGAPDH)-Avg.

(CtSNAP47-CtGAPDH)

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。定量资料用均数±标准差()表示。肿瘤及瘤旁组织SNAP47 表达均数比较采用配对t 检验，两独立样本均数的比较视方差齐性检验(以0.1作为检验水准进行Levene 检验)结果，当方差齐同时，用两独立样本t 检验，当方差不齐时，用Satterthwaite 校正t 检验。以P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SNAP47 mRNA 在肺腺癌及癌旁组织中的表达 SNAP47 mRNA 在正常肺组织和肺癌组织中都有表达，且52 例中有41 例(78.9%)的SNAP47 mRNA 表达水平高于正常组织，其中33 例(63.5%)比正常组织高2 倍以上，20 例(38.5%)比正常组织高4 倍以上，差异均具有统计学意义(P ＜0.05)。

2.2 肺癌组织中SNAP47 mRNA 表达与临床病理特征的相关性分析 在低分化与中高分化的患者中，SNAP47 mRNA 表达的差异不具有统计学意义(P=0.476)。SNAP47 mRNA 的表达量与患者性别和年龄及胸膜侵犯情况之间的差异无统计学意义(P ＞0.05)。但在不同临床分期中不同，肺癌Ⅱ、Ⅲ期患者SNAP47 mRNA 的表达水平显著高于I 期患者，N1+N2 组患者SNAP47 mRNA 的表达水平也明显高于N0 组患者(P ＜0.05)。见表1。

表1 SNAP47 mRNA 表达与临床资料相关性分析Table 1 Correlation between SNAP47 mRNA level and clinicopathologic characteristics

表1 SNAP47 mRNA 表达与临床资料相关性分析Table 1 Correlation between SNAP47 mRNA level and clinicopathologic characteristics

特征 n 表达比例 P值性别男 29 4.588±4.415 0.611女 23 5.203±4.201年龄(岁)≥60 29 4.886±3.378 0.969＜60 23 4.839±4.978胸膜侵犯有 28 5.368±4.112 0.365无 24 4.267±4.505淋巴结转移N0 28 3.360±2.987 0.005 N1+N2 24 6.609±4.942分化程度低 13 4.084±4.507 0.476中高 39 5.118±4.245 TNM 分期Ⅰ 23 2.718±2.370 0.001Ⅱ、Ⅲ29 6.558±4.730

3 讨 论

寻找并研究肺癌侵袭转移相关的基因，对改善肺癌患者预后意义重大［13-14］。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)降解细胞外基质是肿瘤的侵袭和转移的关键环节。SNARE 复合物(VAMP3，Stx13 及SNAP23)参与基质金属蛋白酶的转运分泌进而降解细胞外基质实现纤维肉瘤细胞(HT-1080)的侵袭转移［9］。而Williams 等［15］在侵袭性乳腺癌细胞株中证实SNARE 复合物(VAMP7，Stx4 及SNAP23)介导侵袭伪足形成和膜相关MT1-MMP 的转运从而影响肿瘤细胞侵袭。

SNAP 家族作为SNARE 家族的一员，在MMP转运过程中起到了关键的作用，从而参与了肿瘤的侵袭、转移。本组通过前期的芯片发现SNAP47 基因在肺腺癌中的表达明显增高。因此，本研究探讨SNAP 家族在肺癌组织中的表达及其临床意义。研究结果显示:TCGA 数据库中，SNAP47 在包括肺腺癌在内的非小细胞肺癌中的表达明显高于对应瘤旁组织，SNAP23 为低表达，SNAP25 及SNAP29 的表达无明显差异。随后，针对52 对新鲜标本组织，应用qRT-PCR 方法检测了SNAP47 mRNA 的表达，结果发现:癌组织标本中SNAP47 mRNA 的表达明显高于癌旁组织，且SNAP47 mRNA 的表达与肿瘤的临床分期和淋巴结转移等情况有密切的联系。SNAP47 mRNA 的表达在不同TNM 分期有显著的差异，随着肺腺癌临床分期的增高，SNAP47 的表达也相应增高，在Ⅱ、Ⅲ期患者的表达水平明显高于I期，根据此结果可以推测SNAP47 参与了肺腺癌的发生及发展过程。N1+N2 组患者SNAP47 的表达水平明显高于N0 组，表明SNAP47 的表达水平与淋巴结转移情况有密切的联系，这从另一方面提示SNAP47 参与了肺腺癌的发生发展。由于肿瘤较小，无法进行T 分期的分层分析，因此SNAP47 是否与肺癌的T 分期相关仍需进一步的研究。

综上所述，SNAP47 的高表达可能与肺癌的发生发展有关，参与了肺腺癌的浸润转移及淋巴转移，有望作为肺癌的预后和转移指标或治疗靶点。基于前期SNAP 家族蛋白在MMP 转运中的研究，我们推测SNAP47 也可能通过增加MMP 的转运实现肺癌的侵袭转移。进一步的体内体外实验有助于明确SNAP47 对于肺癌侵袭转移的作用并揭示其可能的机制。

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