41例EDTA依赖性血小板降低的原因及校正方法探讨

严强，古月

内江市市中区人民医院检验科,四川内江 641000

血小板(Platelet,PLT)参与了人体凝血和止血效应，具有重要的生理学作用。血小板计数是判断凝血功能的重要指标。血小板减少是引起患者出血时间延长的重要原因之一，患者在严重损伤或在激状态可发生出血。假性血小板减少(pseudothrombocytopenia，PTCP）是由于各种原因引起的血小板聚集导致仪器计数血小板减少的假象。EDTA盐抗凝剂是导致血常规分析血小板计数假性降低的主要原因,并建议改用枸橼酸钠抗凝剂重新采集患者血液标本进行血小板计数[1-2]。最近报道，枸橼酸盐同样可以导致离体后的血液标本中血小板假性降低，并且随着时间的延长，血小板计数降低得更明显[3-4]。该研究采用血液分析仪稀释法和肝素抗凝剂法对41例EDTA依赖性假性血小板降低的血液标本血小板检测方法进行比较研究，旨在找出针对该类标本最适宜的血小板计数方法，避免因血小板假性降低导致的临床误诊或漏诊。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2014年7月—2015年7月在日常的检验工作中发现的EDTA依赖性血小板降低的门诊及住院患者共41例，其中男性 21例，女性 20例。

1.2 仪器与试剂

仪器为日本SYSMEX KX-21自动分析仪，试剂为均为仪器配套原装试剂，真空采血管采用成都瑞琦科技实业有限责任公司生产的 EDTA-K2抗凝采血管和枸橼酸钠抗凝采血管。

1.3 研究方法

1.3.1 仪器全血法 采集患者外周静脉血，注入EDTAK2抗凝的真空采血管，立即充分混匀后，严格按照仪器操作规程，在不同时间点(0～5 min、15 min、30 min、1 h、2 h)进行血小板计数。

1.3.2 仪器稀释法 将EDTA-K2抗凝全血充分混匀后作26倍稀释，即取20μL全血加入到500μL稀释液中，充分混匀后在不同时间点(0～5 min、15 min30 min、1 h、2 h)，应用KX-21自动血液分析仪进行血小板测定。

1.3.3 枸橼酸钠抗凝剂法 对纳入的研究对象，重新抽血外周静脉血注入枸橼酸钠抗凝的真空采血管，立即充分混匀后，严格按照仪器操作规程，在不同时间点(0～5 min、15 min、30 min、1 h、2 h)在KX-21 自动血液分析仪上进行血小板计数。

1.3.4 手工法 以草酸铵作为抗凝剂，采用手工法进行计数。严格按照《全国临床检验操作规程》第4版进行操作[5]。具体操作方法为:采患者指血20μL置于380μL草酸铵稀释液中，充分混匀后在显微镜下计数。每份标本计数2次，取平均值。 同时，对每份血液标本采用瑞氏染色法进行血涂片染色，干燥后在显微镜下观察血小板分布情况。

1.4 统计方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理和统计学分析，计量资料以平均值±标准差（±s）表示，比较采用t检验，计数资料用率（%）表示，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 41例EDTA依赖性血小板降低的原因分析

对出现EDTA依赖性血小板降低的标本进行分析发现，导致该现象发生的具体原因包括血小板聚集、血小板卫星现象、采血不通畅、抗凝剂不足和抗凝剂过量，发生率分别为51.2%、2.4%、22.0%、9.8%和14.6%，见表1。

表1 41例EDTA依赖性血小板降低的原因分析

2.2 不同方法测定假性血小板降低的患者标本检测结果

以手工法为判断标准，在不同时间点分别用KX-21全血法、KX-21稀释法和枸橼酸钠抗凝法对患者血小板进行测定，结果如表2所示。采血后0～5 min各种测定方法与手工法比较，血小板测定结果差异无统计学意义（P＞0.05）。而15 min后，KX-21仪器法与手工法比较，血小板测定结果差异具有统计学意义（P＜0.05）。稀释法在2 h内与手工法测定结果差异无统计学意义（P＞0.05）。枸橼酸盐抗凝法在1 h后与手工法比较，血小板测定结果差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 不同方法对假性血小板降低患者标本的测定结果比较（±s）

表2 不同方法对假性血小板降低患者标本的测定结果比较（±s）

注：△与手工法比较，P＞0.05；▲与手工法比较，P＜0.05。

测定时间KX-21全血法KX-21稀释法 枸橼酸钠抗凝法 手工法0～5 min 15 min 30 min 1 h 2 h（231±32）△（79±26）▲（48±19）▲（21±6）▲（20±5）▲（228±29）△（225±30）△（221±33）△（226±35）△（231±36）△（223±23）△（226±21）△（169±17）△（101±14）▲（68±12）▲223±24 220±26 230±35 226±26 217±22

3 讨论

血小板假性降低与多种疾病密切相关，往往伴发于外科手术、创伤、烧伤、脓毒血症、肿瘤、自身免疫性疾病、血液系统疾病、传染性单核细胞增多症等。肿瘤患者长期使用化疗或放疗，不仅对造血系统产生抑制作用，而且会引起血小板结构和功能的改变。血液系统疾病如白血病等会严重影响造血功能，血小板不经数量减少，而且形态结构和功能也发生实质性改变，容易发生EDTA依赖性血小板降低。儿科患者主要是由于采血不通畅，采血过程中血小板聚集和粘附性改变，EDTA盐进一步与血小板发生相互作用，聚集和凝集更为明显。

目前认为，血小板假性降低主要与EDTA盐抗凝剂有关[6-7]。PTCP的发生可能与EDTA盐抗凝剂导致血小板活化过程有关，活化的血小板与存在于人体血液中的自身抗体结合，导致血小板形态结构发生改变，导致血小板膜表面的某种隐匿性抗原表位构象的改变，从而促进和加速了血小板与血浆中的纤维蛋白原聚集。此外，还可能与患者血液存在冷抗血小板的自身抗体有关[8]。这种EDTA依赖性冷抗血小板自身抗体直接作用于血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa，而糖蛋白Ⅱb/Ⅲa是血小板膜上最重要的糖蛋白，参与血小板的黏附、聚集反应[9]。与血小板结合的自身抗体Fc段可与单核细胞或淋巴细胞的Fc受体结合，出现血小板卫星现象[10]。

该研究通过对出现EDTA依赖性血小板降低的标本进行研究分析发现，导致该现象发生的具体原因主要包括血小板聚集、血小板卫星现象、采血不通畅、抗凝剂不足和抗凝剂过量，发生率分别为51.2%、2.4%、22.0%、9.8%和14.6%。这提示血小板聚集可能是发生EDTA依赖性血小板降低的主要机制。

目前，关于EDTA引起的假性血小板降低的校正方法，已报道的方法主要有3种，即直接手工计数、更换抗凝剂和即刻全血计数法[11-13]。以手工法为判断标准，在不同时间点分别用KX-21全血法、KX-21稀释法和枸橼酸钠抗凝法对患者PLT进行测定，结果如表2所示。采血后0～5 min各种测定方法与手工法比较，血小板测定结果差异无统计学意义（P＞0.05）。而15 min后，KX-21仪器法与手工法比较，血小板测定结果差异具有统计学意义（P＜0.05）。稀释法在2 h内与手工法测定结果差异无统计学意义（P＞0.05）。枸橼酸盐抗凝法在1 h后与手工法比较，血小板测定结果差异具有统计学意义（P＜0.05）。枸橼酸盐抗凝剂计数血小板，在采血后短时间内不会引起血小板降低，而随着时间的延长，血小板计数也会随之下降。而血液分析仪稀释法是一种较为理想的校正方法，测定速度快，可实现自动化检测，准确度与手工计数法接近。与文献报道相符[14]。

综上可知，EDTA依赖性血小板降低发生的原因主要包括血小板聚集、血小板卫星现象、采血不通畅、抗凝剂不足和抗凝剂过量。当仪器出现与临床诊断严重不符的血小板异常降低时，应及时分析原因，通过更换抗凝剂种类、适当控制标本放置时间，采取仪器稀释法，或通过手工计数和血涂片染色观察可有效区分真性与假血小板计数降低，从而提高检测结果的准确度。血液分析仪稀释法是一种较为理想的校正方法，用于临床实验室。

[1]张建萍.EDTA依赖性假性血小板减少症及检测方法分析[J].重庆医学，2010，39(20):2782.

[2]李芳，杜宗孝.乙二胺四乙酸二钠相关假性血小板减少现象及纠正方法分析[J].宁夏医学杂志，2011,33(2):169.

[3]李孟兰.EDTA-K2依赖性血小板假性减少结果分析及处理[J].医药前沿，2014（33）：91-92.

[4]刘晓燕，周灵玲，胡晓蕾.温度与抗凝剂对假性血小板减少的影响[J].浙江实用医学,2015,20(5):369-370.

[5]尚红，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程[S].4版.北京:人民卫生出版社，2012:136-143.

[6]Xiao Y,Yu S,Xu Y.The Prevalence and Biochemical Profiles of EDTA-Dependent Pseudothrombocytopenia in a Generally Healthy Population[J].Acta Haematol,2015,134(3):177-180.

[7]Tomicic M,Vuk T,Gulan-Harcet J.Anticoagulant-induced pseudothrombocytopenia in blood donors[J].Transfus Med.2015，25(1):47-48.

[8]Sánchez Guiu IM,Martínez-Martinez I,Martínez C,et al.An atypical IgM class platelet cold agglutinin induces GPVI-dependent aggregation of human platelets[J].Thromb Haemost,2015,114(2):313-324.

[9]于付生,刘青,史云霞.择期PCI术后替罗非班诱发重度血小板减少症一例[J].中国实用医刊,2015(20):123-128.

[10]王伟，王海梅，杨萍，等．EDTA-K2和枸橼酸钠同时依赖的假性血小板减少病例分析[J].中华全科医学，2013，11(5):786-787．

[11]梁培松，王结珍，杨山虹，等．纠正 EDTA-K2抗凝剂致假性血小板减少方法的探讨[J].国际检验医学杂志，2013，34(18):2448-2449．

[12]邵永生，粱巍．不同计数模式在血小板减少症中应用价值[J]．中华实用诊断与治疗杂志，2013,7(10):1036-1037．

[13]李艳，孙家祥．EDTA-K2抗凝剂致血小板假性减少的原因及纠正方法探讨[J]．海南医学,2013,24(21):3187-3189．

[14]刘爱胜，文艳.0.9g/dL生理盐水稀释解决EDTA依赖性血小板假性减少的方法研究[J].现代检验医学杂志,30(2):128-131.