苦瓜藤中苦瓜素Ⅰ的分离鉴定和抑菌作用

葛晓环,余 平,曾哲灵,刘 兵

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学生命科学与食品工程学院,江西南昌330031；3.南昌大学环境与化学工程学院,江西南昌330031)

苦瓜藤中苦瓜素Ⅰ的分离鉴定和抑菌作用

葛晓环1,2,余 平3,*,曾哲灵1,3，*,刘 兵3

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学生命科学与食品工程学院,江西南昌330031；3.南昌大学环境与化学工程学院,江西南昌330031)

本文研究苦瓜藤的三萜类化学成分及其抑菌作用。采用75%(v/v)乙醇提取及D101大孔树脂、硅胶、MCI树脂和ODS硅胶等多种吸附分离方法从苦瓜藤中分离三萜类化合物,经超高效液相、电喷雾质谱、核磁共振测定、分析所得三萜类化合物的纯度、分子量及结构,采用肉汤稀释法测定所得三萜类化合物的抑菌活性。结果表明:苦瓜藤中分离的三萜类化合物经鉴定为19-Norlanosta-5,24-diene-9-carboxaldehyde,3,7,23-trihydroxy-,(3β,7β,9β,10α,23α)-,俗名苦瓜素Ⅰ;苦瓜素Ⅰ对大肠杆菌(EscherichiacoliAB1157)无显著抑菌活性,MIC值大于100 μg/mL。其对金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusNewman)的生长具有抑制作用,MIC值达到12.5～25 μg/mL。

苦瓜藤,苦瓜素Ⅰ,分离,鉴定,抑菌

苦瓜是一种一年生的攀援草本,茎细长。其作为一种蔬菜广泛种植于热带,亚热带地区。其果实常被用于辅助治疗糖尿病。对其化学成分的研究显示,其果实、茎、叶、根和种子含有大量的葫芦烷型三萜类化合物[1-5]、少量的甾体化合物[6]、生物碱及其他类化合物[7]。相关药理研究表明苦瓜粗提物和部分三萜类化合物具有降糖作用[1,8-9]、抗肿瘤作用[10-12]、抗氧化作用[3,13]和减肥作用[14-15]。

有关苦瓜及其藤中生物活性物质抑菌作用的研究报道仅限于苦瓜提取物和总皂苷[16-19]、苦瓜叶提取物[20],苦瓜藤提取物[20-21],还未见有关苦瓜藤中三萜类单体化合物抑菌作用的研究报道。研究苦瓜藤中三萜类化合物的抑菌作用,对充分利用苦瓜藤资源,变废为宝具有重要意义。本文采用萃取、吸附分离方法自苦瓜藤中分离出三萜类化合物,采用超高效液相、电喷雾质谱、核磁共振一维谱等方法分析所得三萜类化合物结构,并采用肉汤稀释法研究化合物的抑菌作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦瓜藤粉末(过40目筛) 产于江西吉安;大肠杆菌(EscherichiacoliAB1157),金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusNewman) 由国家新药筛选中心提供;D101大孔吸附树脂 安徽三星树脂科技有限公司;GF254硅胶板,柱层析硅胶 青岛海洋化工厂分厂;MCI树脂 日本三菱化学株式会社;十八烷基键合硅胶(Octadecylsilyl silica gel,ODS silica gel) 日本YMC有限公司;甲醇,二氯甲烷,三氯甲烷,硫酸,乙醇,氯化钠,二甲亚砜 广东西陇化工股份有限公司,分析纯;高氯酸 天津市鑫源化工有限公司,分析纯;香草醛 天津市大茂化学试剂厂,分析纯;乙腈 德国CNW公司,色谱纯;氘代吡啶 美国Cambridge Isotope Laboratories公司;96孔板(透明) 美国corning公司,对照样品DMSO溶液为卡那霉素(30 mg/mL)、万古霉素(4 mg/mL)、四环素(5 mg/mL) 由国家新药筛选中心提供。

超高效液相色谱仪(Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC)Agilent1290,配蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector,ELSD) 美国Agilent公司;超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS(Mass Spectrum)),Agilent 6538 Q-TOF System) 美国Agilent公司;核磁共振仪(Nuclear Magnetic Resonance(NMR),Bruker Avance Ⅲ 600 MHz) 德国Bruker公司;50L双层玻璃提取罐 武汉世纪超杰实验仪器有限公司;SW-CJ-2F超净工作台 苏州净化设备总厂;WFZ765PC型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;BS223S型电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司;Synergy H1 全功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;GeneQuant 100紫外分光光度计 美国GE公司。

1.2 实验方法

1.2.1 苦瓜藤中三萜类化合物的提取分离 称取16 kg苦瓜藤粉末分批置于50 L提取罐中,在提取温度为60 ℃、料液比(苦瓜藤粉∶乙醇)为1∶10的条件下,用75%(v/v)乙醇浸提2 h,过滤,然后在滤渣中继续加入75%(v/v)乙醇浸提,过滤,反复提取直至用香草醛-高氯酸法[22]检测不出滤液中三萜类化合物为止,合并滤液,真空浓缩得粗提物浸膏1312 g。

浸膏上预先处理好的D101大孔吸附树脂柱[22](16 cm×100 cm),先用蒸馏水洗去水溶性杂质。再用20%(v/v)、40%(v/v)、60%(v/v)、80%(v/v)、95%(v/v)的乙醇梯度洗脱(每个梯度洗脱50 L),分别收集各洗脱部分,真空浓缩干燥,采用香草醛-高氯酸法测定三萜类化合物含量,结果显示:80%(v/v)乙醇洗脱部分(200 g)含有大量三萜类化合物。

取该洗脱部分甲醇溶解,硅胶拌样,旋干后上预处理好的硅胶色谱柱,用0%(v/v)～30%(v/v)的甲醇-二氯甲烷溶剂体系梯度洗脱,采用薄层层析法(TLC)跟踪合并Rf值和显色均相同的洗脱液,5%(v/v)的甲醇-二氯甲烷溶剂体系洗脱部分共计41.2 g。

该部分配制成1 g/mL的甲醇溶液后过滤,滤液上预处理好的MCI树脂柱,10%(v/v)～100%(v/v)的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱,TLC跟踪合并Rf值和显色均相同的洗脱液,90%(v/v)的甲醇-水溶剂体系洗脱部分标记为A,(27g);A部分重复上样、梯度洗脱,TLC跟踪合并Rf值和显色均相同的洗脱液,80%(v/v)～85%(v/v)的甲醇-水溶剂体系洗脱部分标记为A1,共计20.8 g。

取1.5 g A1部分甲醇复溶后上预处理好的ODS色谱柱,30%(v/v)～100%(v/v)的甲醇-水溶剂体系梯度洗脱,TLC跟踪合并Rf值和显色均相同的洗脱液,得到单体化合物T2(325 mg),计算得率约为0.028%。

1.2.2 化合物T2的纯度及结构分析

1.2.2.1 UPLC测定化合物T2的纯度 根据文献[23]的方法并稍加改动。称取5.0 mg化合物T2,溶于5 mL甲醇中,配制成1.0 mg/mL的溶液,过滤,待测。采用UPLC测定化合物T2的纯度。UPLC测试条件为:色谱柱:ZORBAX SB-C18,1.8 μm,50×2.1 mm;流速:0.3 mL/min;温度25 ℃;时间:25 min;流动相:乙腈∶水(10∶90～100∶0);进样量:3 μL;检测器:蒸发光散射检测器(ELSD),喷雾器流速1.8 L/min,喷雾器温度30 ℃,漂移管温度40 ℃。

1.2.2.2 MS测定化合物T2的分子量 称取1.0 mg化合物T2,溶于5 mL甲醇中,配制成0.2 mg/mL的溶液,过滤,待测。采用MS测定化合物T2的分子量。MS测试条件为:离子源:电喷雾(ESI);雾化压力:40psi;干燥器流速:10 L/min;干燥器温度:350 ℃;分流比:1∶3;添加少量甲酸。

1.2.2.3 NMR测定化合物T2的结构 称取5 mg化合物T2溶于0.5 mL氘代吡啶(pyridine-d5)中,得10 mg/mL的待测样品溶液,采用NMR测定该化合物的氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)、无畸变极化转移增强谱(DEPT)。

1.2.3 化合物T2的抑菌作用 根据文献[24]的方法测定化合物的抑菌作用。称取化合物T2 1 mg左右,用DMSO溶解至10 mg/mL母液,-20 ℃保存。分别取S.aureusNewman、E.coliAB1157单克隆在37 ℃过夜培养;分光光度计测定OD600值,分别用相应培养基稀释菌液至OD600=0.01,37 ℃继续培养5～8 h,至OD600=0.6(所对应的菌落个数大概在(5～10)×107个/毫升);化合物按照相应培养基稀释到工作浓度;菌液稀释400倍后,取50 μL加至透明底微孔板上50 μL含有化合物的培养基中,37 ℃过夜培养,16 h后酶标仪测定OD600值,确定有无细菌生长,计算MIC。

2 结果与分析

2.1 结构分析

2.1.1 化合物T2的理化性质 化合物T2为白色无定形粉末,易溶于甲醇、乙醇,紫外254 nm处无吸收,采用两种展开剂展开,均为一个点(展开剂：三氯甲烷∶甲醇=100∶8,三氯甲烷∶丙酮=3∶1)。香草醛-高氯酸法显色呈蓝紫色,提示为三萜类化合物。

2.1.2 化合物T2的纯度 UPLC-ELSD结果如图1所示:化合物T2的保留时间(tR)为11.748 min,且纯度高于99%,达到进行核磁共振检测所需纯度。

图1 化合物T2的UPLC-ELSD图谱Fig.1 The UPLC-ELSD chromatogram of compound T2

2.1.3 化合物T2的分子量 化合物T2的高分辨ESI-MS结果显示:准分子离子峰m/z为495.3353[M+Na]+、507.3291[M+Cl]-。

2.1.4 化合物T2的结构解析1H-NMR谱显示:该化合物存在7个甲基,四个甲基连在季碳上(0.90,0.95,1.21,1.51),2个甲基连在烯碳上(1.71,1.73),1个甲基连在次甲基上(1.18(d,J=6 Hz)),3个质子连在结构上有羟基的碳上(3.85(1H,brs),4.39(1H,d,J=6 Hz),4.85(1H,m)),其中至少有一个紧挨着烯碳,有一个连在季碳上的醛基质子(10.70),13C-NMR谱和DEPT谱显示:有三个羟甲基碳(76.2,66.2,65.6),四个三取代双键碳(146.2,124.8,132.4,131.3)和一个醛基碳(208.3)。这些数据提示该化合物为葫芦烷型三萜类化合物。氢谱,碳谱,结合高分辨率质谱m/z 507.3291[M+Cl]-(计算值507.3241),可得分子式为C30H48O4。化合物氢谱δH值,碳谱δC值与已报道的化合物19-Norlanosta-5,24-diene-9-carboxaldehyde,3,7,23-trihydroxy-,(3β,7β,9β,10α,23α)-[25-26]的数据一致,故确定化合物T2与该化合物结构一致,俗名为苦瓜素Ⅰ(momordicineⅠ)(图2)。

图2 苦瓜素Ⅰ的化学结构式Fig.2 Chemical structure of momordicineⅠ

2.2 抑菌作用分析

由表1可知,苦瓜素Ⅰ对大肠杆菌(EscherichiacoliAB1157)无显著抑菌活性,MIC值大于100 μg/mL。其对金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusNewman)的生长具有抑制作用,其MIC值达到12.5～25 μg/mL。Rakholiya等人[21]发现苦瓜藤叶水提取物和醇提取物对金黄色葡萄球菌等多种菌株有抑制作用，且醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用比水提取物要好。这与本实验结论一致。而且本实验进一步阐明了苦瓜藤脂溶性提取物抑菌作用的物质基础包括苦瓜素Ⅰ。张静雅等人[27]发现苦瓜的70%乙醇提取物对革兰氏阳性菌的抑菌活性明显优于革兰氏阴性菌,对金黄色葡萄球菌的抑制效果强,对大肠杆菌抑制作用较弱。由于苦瓜皂苷的苷元部分结构[1,28-29]与苦瓜素Ⅰ相同或相似,提示苦瓜素Ⅰ和苦瓜皂苷的抑菌作用可能有相同的作用机制。

表1 苦瓜素Ⅰ的MIC测定

3 结论

本实验结果表明,苦瓜藤中含有的苦瓜素Ⅰ是其粗提物抗菌作用的物质基础之一,苦瓜素Ⅰ对金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusNewman)有抑菌效果。这为苦瓜藤中天然抑菌物质的开发与研究提供了依据。这方面的深入研究有望为苦瓜藤的综合利用开辟一条新的途径。

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Separation,identification and its antibacterial activity of momordicineⅠfrom the vine ofMomordicaCharantiaL.

GE Xiao-huan1,2,YU Ping3,*,ZENG Zhe-ling1,3,*,LIU Bing3

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2. School of Life Science and Food Engineering,Nanchang University,Nanchang 330031,China；3.School of Environmental and Chemical Engineering,Nanchang University,Nanchang 330031,China)

The study was aimed to determine the structure and antibacterial activity of triterpenoids from the vine ofMomordicaCharantiaL.. The 75% ethanol(v/v)was used to extract total triterpenoids from the vine ofMomordicaCharantiaL.. The monomer compound was separated by means of solvent extraction,D101 macroporous adsorption resin column chromatography followed by MCI gel,silica gel and Octadecylsilyl silica gel(ODS silica gel column chromatography). The structure was determined by UPLC,ESI-MS,1D-NMR. The compound was identified as 19-Norlanosta-5,24-diene-9-carboxaldehyde,3,7,23-trihydroxy-,(3β,7β,9β,10α,23α)-,whose common name was momordicineⅠ. Then the broth dilution method was used to test the minimum inhibitory concentrations(MIC)of triterpenoids. MomordicineⅠhad no significant antibacterial activity againstEscherichiacoliAB1157. Its MIC were more than 100 μg/mL.MomordicineⅠexhibited the inhibitory effect againstStaphylococcusaureusNewman,its MIC were ranged from 12.5 μg/mL to 25 μg/mL.

vine ofMomordicaCharantiaL.;momordicineⅠ;seperation;identification;antibacterial activity

2014-08-20

葛晓环(1988-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail：15879173869@163.com。

*通讯作者:余平(1982-)，男，博士，讲师，研究方向：药食同源植物资源开发，E-mail：cpu_yuping@126.com。 曾哲灵(1965-)，男，博士，教授，研究方向：食物资源开发与生物质转化，E-mail：zlzengjx@163.com。

南昌大学科研启动经费(06301081)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)21-0118-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.016