米糠蛋白ACE抑制肽在大鼠体内降压效果的研究

翟爱华，袁文帅

(黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆 163319)

米糠蛋白ACE抑制肽在大鼠体内降压效果的研究

翟爱华，袁文帅

(黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆 163319)

采用灌胃和静脉注射的方法,观察了米糠蛋白ACE抑制肽对应激性高血压(SHR)大鼠的降压效果,并与卡托普利的降压效果进行了比较。分别以50、100、150 mg/kg·bw 剂量的米糠蛋白ACE抑制肽一次性给药后,每2 h测量大鼠血压,连续测量8 h;实验持续4周,每天灌胃一次,每周测量血压及体重一次。SHR大鼠给予米糠蛋白ACE抑制肽后,血压均显著下降(p<0.05),并均在灌胃后2 h 达到最低值,血压下降最大幅度为(31±6.8)mmHg;而正常大鼠灌胃米糠蛋白ACE抑制肽后血压无显著变化,灌胃卡托普利则会明显降低其血压;长期灌胃米糠蛋白ACE抑制肽可使SHR大鼠血压下降明显(p<0.05),且降压效果稳定。

米糠蛋白ACE抑制肽,SHR大鼠,降血压

血管紧张素转化酶(Angioensin-I Converting Enzyme,简称ACE)抑制肽,又被称为降血压肽(ACEIP),是一种能够抑制ACE活性的分子量偏小的多肽类物质[1],降压效果明显而稳定,且只对高血压患者有降压功效,对血压正常的机体没有影响,安全性高且无毒副作用[2-3]。

食源性ACE抑制肽由于其天然安全、降压效果显著等优点,受到人们越来越多的关注。有研究证明人们分别从不同来源的原料中制备出了高效的ACE抑制肽[4-6],对植物蛋白源的研究则有大豆、玉米、花生等[7-11]。由于天然存在的ACE抑制肽的来源有限,化学合成的ACE抑制肽又有副作用,近年来对ACE抑制肽的研究大多集中在制备方法及分离纯化上[12-13]。米糠是一种具有极大开发潜力的资源,研究人员发现米糠蛋白水解产物中具有较强的ACE 抑制活性肽成分[14],国内还没有对于米糠蛋白肽在体内降血压效果的研究。

ACE抑制肽口服后会被体内各种酶类分解降低其降血压活性[15]。米糠蛋白ACE抑制肽能否可以不被胃肠中的酶分解进入体内达到降血压效果,本实验通过应激性高血压大鼠(SHR)的一次性给药和长期给药观察,并与降压药物卡托普利的效果比较,从体内实验角度研究米糠蛋白ACE抑制肽的降血压效果,为其开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

自发性高血压大鼠(spontaneously Hypertensive Rats,SHR) 雄性,8～10周龄,体重200～240 g,上海高血压研究所;普通(Sprague-Dawley,SD)雄性大鼠,同周龄,由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供;米糠蛋白ACE抑制肽为实验室自制;卡托普利(Captopril)12.5 mg/片,自上海皇象铁力蓝天制药有限公司购买。

BP-6型动物无创血压测试系统 成都泰盟科技有限公司;ALPHA1-2LD plus冷冻干燥机 德国Christ公司;AR2140电子分析天平 梅特勒托多利仪器有限公司;TGL16B型台式离心机 上海安亭科学仪器制造厂;JJ-1电动搅拌器 常州国华电器有限公司;C型超声波药品处理机 济宁市金百特电子有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米糠蛋白ACE抑制肽的制备 米糠蛋白采用碱性蛋白酶Alcalase在温度45 ℃,加酶量3000 U·g-1,酶解pH8.5,米糠蛋白底物浓度3%酶解2 h后得到最大为71.1%的ACE抑制率的水解液[16],经模拟移动硬床色谱分离纯化,将纯化后的ACE抑制肽经旋转蒸发和冷冻干燥处理,得到淡黄色粉末状米糠蛋白肽进行ACE抑制活性检测。

1.2.2 ACE抑制肽的活性测定 参照黎观红[17]体外检测方法经适当调整方法如下:将ACE(血管紧张素转换酶抑制剂)底物HHL(马尿酰-组胺酰-亮氨酸)溶于0.1 mol/L的含0.3 mol/L NaCl的硼酸盐缓冲液中(pH8.3),配成5 mmol/L的浓度。精确量取5 mol/L HHL溶液80 μL,并且与40 μL ACE抑制剂进行混合,保持37 ℃温度不变,置于水浴锅中5 min。之后用移液枪加入10 μL 0.1 U/mL ACE溶液,37 ℃反应30 min。加入200 μL 1 mol/L HCl溶液终止反应。再加入1.2 mL乙酸乙酯均匀混合15 s,以萃取反应体系中的马尿酸。离心(1000×g)10 min后取出0.9 mL酯层溶液转入另一试管中,80 ℃烘干,并重新溶于3 mL去离子水中,用紫外分光光度计228 nm处的波长的吸光度值,计算出ACE抑制的程度。计算公式如按公式1所示计算:

式(1)

注:Aa:水解液组的吸光度;Ab:对照组吸光度;Ac:空白组吸光度。

1.2.3 大鼠饲养条件 自发性高血压大鼠(SHR)随机分笼饲养,每笼6只,环境温度(22±1)℃,相对湿度55%±5%,标准饲料喂养,自由进食和饮水,自然光照。大鼠适应环境7d后开始实验[18]。

1.2.4 灌胃给药实验SHR大鼠30只在实验室适应一周后,根据所测基础血压和体重的大小,按随机分组设计分为5组,每组6只:SHR大鼠空白对照组,灌胃同等剂量生理盐水;低剂量组,灌胃剂量按50mg/kg·bw肽计算;中剂量组,灌胃剂量按100mg/kg·bw肽计算;高剂量组,灌胃剂量按150mg/kg·bw肽计算;药物对照组,灌胃剂量按5mg/kg·bw加入卡托普利。

给药分为2种:一次性给药实验,测定大鼠在给药前及给药后2、4、6、8h的血压值,每只大鼠每次测定3次取平均值;长期给药实验,连续28d每天定时给药一次,每7d测量血压和体重一次。

普通SD大鼠12只,实验室适应一周后,根据所测基础血压和体重的大小,按随机分组设计分为2组每组6只:(SD)正常血压大鼠对照组,灌胃剂量按150mg/kg·bw肽计算;(SD)正常大鼠药物对照组,灌胃剂量按5mg/kg·bw加入卡托普利。也按一次性给药实验,与SHR大鼠的空白对照组和高剂量组进行对比。

1.2.5 静脉注射给药实验SHR大鼠30只在实验室适应一周后,根据所测基础血压和体重的大小,按随机分组设计分为5组,每组6只:SHR大鼠空白对照组,灌胃同等剂量生理盐水;低剂量组,灌胃剂量按20mg/kg·bw肽计算;中剂量组,灌胃剂量按40mg/kg·bw肽计算;高剂量组,灌胃剂量按60mg/kg·bw肽计算;药物对照组,灌胃剂量按2mg/kg·bw加入卡托普利。

静脉注射实验按照一次性给药测定注射前及注射后2、4、6、8、10h的大鼠血压,每只大鼠每次测定三次取平均值。

1.2.6 实验动物血压测定 将待测大鼠装入鼠笼,按实验的待测顺序放入BP-6动物无创血压测试仪的保温箱中,在36 ℃下将大鼠预热10min,待电脑显示器上出现待测大鼠的脉搏波形图后,加压,保气10s后放气[19],记录波形图中收缩压值。如此反复3次,取其平均值。

1.2.7 数据统计分析 采用SPSS软件进行数据统计分析,实验数据用均值±标准差表示,实验用单因素方差分析进行比较。

2 结果与讨论

2.1 米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率

经模拟移动硬床色谱纯化后的米糠蛋白水解液测定其ACE抑制率,经计算得制备的米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率为83.1%。

2.2 一次性灌胃米糠蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠血压的影响

一次性灌胃米糠蛋白ACE抑制肽,观察其对SHR大鼠血压的影响,多次测量取平均值以绘制折线图,结果如图1所示。

表1 连续灌胃米糠蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠血压的影响(n=6,x±s)

图1 一次性灌胃实验对SHR大鼠血压的影响(n=6)Fig.1 Variation trends of SHR blood pressure value with a single administration(n=6)

注:与空白对照组比较*表示p<0.05,**表示p<0.01。

给药前各实验组SHR大鼠的血压均在195 mmHg以上。给药后除空白对照组外,其他实验组SHR大鼠的血压值均开始下降,给药2 h后各实验组血压值下降最显著(p<0.05),之后血压值开始缓慢回升,8 h后血压值基本恢复到灌胃前的水平,卡托普利组与高剂量组均能最大限度的降低SHR大鼠的血压值,其中高剂量组下降幅度达到(31±6.8)mmHg,这表明150 mg/kg·bw剂量的米糠蛋白ACE抑制肽的降血压活性可能与5 mg/kg·bw剂量的卡托普利接近。但是卡托普利组血压回升的较慢,给药后8 h时高剂量组SHR大鼠基本与灌胃前血压值持平。从给药时间看,给药后2～4 h出现血压最低值(p<0.05),之后各组SHR大鼠的血压开始缓慢回升,降压效果可以维持6 h左右,给药后8 h各组SHR大鼠血压值与空白对照组相差无几。实验结果表明,米糠蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠的降血压效果有一定的持续性,说明米糠蛋白ACE抑制肽具有良好的短期降压功能,同时给药剂量越大,降压效果越明显。

2.3 一次性灌胃米糠蛋白ACE抑制肽对正常SD大鼠血压的影响

对正常血压的SD大鼠进行高剂量的灌胃处理,每隔2 h测定其血压值,与灌胃SHR大鼠的阴性对照组、高剂量组、卡托普利组进行比较,实验结果如图2所示。

图2 一次性灌胃对正常SD大鼠血压的影响(n=6)Fig.2 Variation trends of SD blood pressure value with a single administration(n=6)

正常SD大鼠的一般在110 mmHg没有SHR大鼠的血压值高,可以看出正常SD大鼠组与SHR大鼠的空白对照组类似,从给药前到给药后8 h血压值均变化不显著,而相同剂量的SHR大鼠的血压出现显著性降低(p<0.05)。实验结果表明,米糠蛋白ACE抑制肽对正常大鼠血压没有抑制作用,有研究表明,卡托普利对正常大鼠血压和SHR大鼠的血压都降低[20],说明米糠蛋白ACE抑制肽降压更安全。

2.4 连续性灌胃米糠蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠血压的影响

对SHR大鼠进行连续灌胃实验,结果如表1所示。

从表1中可知,在给药期间,空白对照组中SHR大鼠的血压值一直在190 mmHg以上,差异没有显著性(p>0.05)。与未给药时比较,灌胃给药后的低剂量组、中剂量组和高剂量组SHR大鼠的血压值均随着服用时间的增加有明显下降,且随着给药时间增加SHR大鼠血压下降的速度减慢并逐渐趋于稳定。低剂量组和中剂量组SHR大鼠的血压从第三周第四周开始才有差异显著性(p<0.05),但中剂量组在第四周有更大的差异性(p<0.01)。高剂量组比卡托普利组降压效果较差,但血压下降平缓。同时也可以看出随着给药剂量的增高,SHR大鼠的血压下降值也随之增大。该结果表明,长期服用米糠蛋白ACE抑制肽可以较好且稳定地降低血压,不会因降压不稳定造成对机体的损伤。

2.5 静脉注射米糠蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠血压的影响

静脉注射不同剂量的米糠蛋白ACE抑制肽,分别在注射前及注射后2、4、6、8 h测定SHR大鼠的血压值。结果如图3。

从图3可以看出,静脉注射后,各组SHR大鼠的血压值均明显下降,注射两小时后各组均降到最低值,而后开始缓慢回升,降压效果可以维持4～6 h,除卡托普利组外各剂量组血压值均恢复到给药前的水平,由此可见,卡托普利组的降压效果更持久。SHR大鼠的血压值随着注射剂量加大下降幅度增大,其中高剂量组血压值在注射2 h后低于卡托普利组,但回升较快,没有卡托普利组的效果持久。

表2 灌胃给药4周后米糠蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠体重的影响(n=6,x±s)

图3 静脉注射实验对SHR大鼠血压的影响(n=6)Fig.3 Variation trends of SHR blood pressure value with intravenous injection(n=6)

将图1与图2 比较可以看出,一次性灌胃米糠蛋白ACE抑制肽与静脉注射对SHR大鼠的降压效果相似,都随着给药剂量的增加而降压效果更好,同时,高剂量组的短期降压效果与卡托普利相当,但药效没有卡托普利持久。但是静脉注射实验的剂量是一次性灌胃实验剂量的0.4倍,由此可见,静脉注射的降压效果远远好于灌胃[19],这可能是因为胃和肠道中存在某些蛋白酶将米糠蛋白ACE抑制肽中的降压组分分解成没有活性的组分,从而影响降压效果。静脉注射是直接进入机体的血液循环能够更快速的达到降压目的而不需要经过胃液和肠道,可以更有效的降低SHR大鼠的血压。

2.6 长期灌胃米糠蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠体重的影响

连续灌胃给药4周后,各组SHR大鼠体重变化情况如表2。与给药前体重比较,空白对照组体重增加了29.8 g,随着药物剂量的增加,SHR大鼠体重增加幅度加大,说明米糠蛋白ACE抑制肽不仅具有降血压的效果,还有促进机体生长的作用。

3 结论

本实验对SHR大鼠进行不同剂量的一次灌胃、连续灌胃及静脉注射,分析及讨论了米糠蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠降血压效果的影响,证明了与卡托普利相比,米糠蛋白ACE抑制肽在降压效果和持续时间上略有不足,且使用剂量要高于卡托普利。静脉注射的降压效果要好于灌胃,可能由于肠道或胃液中的酶类对米糠蛋白ACE抑制肽有一定的分解作用。米糠蛋白ACE抑制肽在机体内具有良好的降压效果,但对正常的SD大鼠没有影响,有促进生长、适合长期服用等优点。米糠蛋白ACE抑制肽组分简单、制备工艺安全,以稻米加工副产物为原料,原料纯天然且成本低廉,因此,米糠蛋白ACE抑制肽作为具有降血压功能的活性肽具有良好的开发价值。

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Study on antihypertensive effect of the rice bran protein ACE inhibitory peptides on rats

ZHAI Ai-hua,YUAN Wen-shuai

(School of Food Science & Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China)

Through adopting the method of gavage and intravenous injection,the antihypertensive effect of rice bran protein ACE inhibitory peptides on the stress-induced hypertension(SHR)rats was observed and then compared with the captopril. Rice bran protein ACE inhibitory peptide one-time dosing of respectively 50,100,150 mg/kg·bw was conducted,with blood pressure measuring for the rats every 2 hours which continuously 8 hours. The experiment lasted four weeks with gavage once daily and weekly measurement of blood pressure and weight once. After the SHR rats were given rice bran protein ACE inhibitory peptides,the blood pressure was decreased significantly(p<0.05),and reached the lowest value in two-hours’ gavage,which was reduced by(31±6.8)mmHg. While the normal rats did not change significantly after it,but captopril can significantly reduce their blood pressure. Long-term gavage of rice bran protein ACE inhibitory peptides can significantly decrease SHR blood pressure(p<0.05)and had a stable antihypertensive effect.

rice bran protein ACE inhibitory peptides;SHR rats;antihypertensive effect

2015-01-15

翟爱华(1971-),女,博士，教授,主要从事粮油精深加工的研究,E-mail:zhaiaihua@sina.com。

高端配方米加工及副产物综合精深加工技术产业化示范(HNK11KF-01)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)23-0348-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.064