响应面法优化苹果渣生产细菌纤维素培养基及产物性能研究

张 雯,李宏杰,刘 兰,齐香君

(1.陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021；2.华东医药集团,浙江杭州 311000)

响应面法优化苹果渣生产细菌纤维素培养基及产物性能研究

张 雯1,李宏杰2,刘 兰1,齐香君1

(1.陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021；2.华东医药集团,浙江杭州 311000)

为提高木醋杆菌(Acetobacterxylinum)发酵苹果渣水解液生产细菌纤维素(Bacterial cellulose,BC)的产量,采用响应面法对发酵培养基进行优化,同时利用傅里叶红外光谱(FT-IR)和X-射线衍射(XRD)对发酵产物BC的性能和结构进行比较。单因素及响应面实验结果确定木醋杆菌(Acetobacterxylinum)发酵苹果渣水解液生产BC的最佳培养基配方为:蔗糖38.44 g、蛋白胨10.91 g、硫酸镁0.85 g、黄嘌呤0.87 g、乙醇10 mL、苹果渣水解液1000 mL、pH6.0,在此条件下BC的产量为7.19 g/L,较优化前(5.65 g/L)提高了27.3%。苹果渣水解液发酵产物BC结构性能与基本培养基发酵产物BC基本一致。说明苹果渣能够替代部分发酵原料发酵生产BC,且不影响BC性能。

苹果渣,细菌纤维素,培养基优化,响应面法

细菌纤维素(Bacterial cellulose,简称 BC)是由生长在液态含糖基质中的革兰氏阴性菌产生的纤维素成分。与植物纤维素相比,BC不含半纤维素和木质素,具有高持水率(大于90%)、高分子量以及较高的结晶度。目前,BC作为一种新型功能材料受到了科学界的广泛关注,已成功地应用于食品、生物医学、膜滤器等多个领域[1-2]。目前BC的生产原料大多为椰汁或复合培养基,主要集中在东南亚等国家。单一的生产原料及地域限制使BC存在生产及运输成本过高等问题,只能应用于高附加值产品的开发。降低生产成本、摆脱原料地域限制是我国BC产业面临的一个重大挑战[3]。

苹果渣是苹果汁加工业的副产物,富含碳水化合物、矿物质等多种营养成分[4-6]。果汁加工业所产生的大量苹果渣用作肥料、燃料的占15%～20%,用作饲料的约为10%,其余绝大部分直接废弃,造成了严重的资源浪费和环境污染。苹果渣中含有的纤维素,经过适当处理后,可以转化为小分子糖,另外,它含有的微量矿物质也是微生物生长繁殖的理想原料。Joshi V.K.等[7-8]将苹果渣分别接入啤酒酵母、产肮假丝酵母、产蛋白酵母等进行固态发酵,Sandhu等人[9]利用酵母发酵苹果渣产生乙醇、粗蛋白和可溶蛋白。本研究拟利用苹果渣水解液作为原料生产BC,采用响应面法对BC发酵培养基进行优化。同时研究发酵产物BC性能,探索苹果渣作为发酵原料对BC的影响。本研究可为BC发酵提供一种廉价原料,为苹果渣的综合利用、附加值的提升和果汁的清洁化生产提供一条新的途径,具有良好的社会效益及经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种 木醋杆菌(Acetobacterxylinum);苹果渣 陕西海升果业发展股份有限公司;纤维素酶 700 EGU/g，诺维信中国生物技术有限公司;其余试剂均采用国产分析纯或生化试剂。

固体培养基 蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、磷酸氢二钠4.40 g、柠檬酸0.80 g、琼脂18.00 g、乙醇10 mL、自来水1000 mL、pH6.0;种子培养基 蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、磷酸氢二钠4.40 g、柠檬酸0.80 g、乙醇10 mL、自来水1000 mL、pH6.0;基本发酵培养基 蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、乙醇10 mL、苹果渣水解液1000 mL、pH6.0。

D/max2200PC全自动X-射线衍射仪 日本Rigalcu;VERTEX 70傅立叶变换红外光谱仪 德国Brucher公司;MG250B恒温培养箱、HYG-1A恒温振荡器 上海新瑞仪器有限公司;XPS-8CA光学显微镜 上海光学仪器有限公司;752型紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 测定分析方法

1.2.1.1 还原糖的测定 采用DNS法[10];

1.2.1.2 BC膜处理 将发酵所得BC膜浸泡于0.10 mol/L NaOH溶液中,80 ℃浸泡30 min,继续加热煮沸2 h,再用蒸馏水反复冲洗,直到pH为7.0,冷冻干燥[11-12];

1.2.1.3 BC膜产量测定 采用称重法[13];

1.2.1.4 BC鉴定及基团分析 采用傅里叶红外光谱扫描法[12](样品处理:取适量BC干膜放入红外光谱仪中进行测定,450 mW,扫描范围4500～400 cm-1,设定分辨率4 cm-1,扫描速度为0.2 cm/s,室温下操作)。

1.2.1.5 BC膜结晶度 采用X-射线衍射光谱扫描法[12](样品处理:BC干膜平整固定在样品架上,铜靶,测试电压40 kV,测试电流100 mA,速率5 °/min,步宽0.02 °,2θ为0～80 °范围扫描。根据X衍射参数,由下面两个计算公式分别计算细菌纤维素的结晶度(Xc)和晶体的粒径L;

式中:I为衍射峰的衍射强度;Iam为无定形区衍射强度;β为半峰宽(rad);k为常数,通常取0.89;λ为X射线波长(0.15406 nm);θ为布拉格衍射角。

1.2.2 苹果渣水解液的制备 取经粉碎干燥的苹果渣,加自来水至液固比为8∶1,加纤维素酶至终浓度为40.00 EGU/g,pH5.2～5.5、55 ℃水解14 h,反应结束后升温至100 ℃,维持10 min灭酶,得苹果渣水解液。

1.2.3 BC的发酵 斜面培养:挑取木醋杆菌保藏菌种划斜面,30 ℃恒温培养箱中培养2～3 d;种子液制备:挑取木醋杆菌活化菌种接种子培养基,30 ℃恒温培养箱中培养1 d,培养液置于30 ℃,160 r/min摇床震荡30 min,得种子液;发酵培养:移取木醋杆菌种子液接入发酵培养基,装液量30 mL/250 mL三角瓶,接种量20%,30 ℃恒温培养箱中静置培养10 d。

1.2.4 单因素实验 以发酵液中BC产量为指标,考察碳源种类及含量(葡糖糖、蔗糖、乳糖,设计质量浓度0.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00 g/L)、氮源种类及含量(牛肉膏、蛋白胨、麸皮,设计质量浓度0.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00、30.00 g/L)、无机盐种类及含量(硫酸镁、磷酸氢二钾、柠檬酸钠,设计质量浓度0.00、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 g/L)、磷酸二酯酶抑制剂种类及含量(黄嘌呤、咖啡因,设计质量浓度0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10、1.50、2.00 g/L)等因素对BC产量的影响。初始培养基配方为:蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、乙醇10 mL、苹果渣水解液1000 mL、pH6.0,后续因素的实验将前一个因素的较佳条件带入以置换初始条件。

1.2.5 响应面实验设计 在单因素实验结果基础上,采用Design Expert7.0软件,根据Box-Benhnken实验设计原理,选取影响较大的因素,以发酵液中BC产量为响应值设计实验,响应面因素水平设计见表1。

表1 响应面因素水平表

1.2.6 发酵产物性能研究 以木醋杆菌(Acetobacterxylinum)为菌种,按照优化培养基配方制备苹果渣水解液发酵培养基发酵生产BC,记为BC-YP,利用基本培养基发酵生产BC记为BC-DZ。利用傅里叶红外光谱仪(FT-IR)及X-射线衍射仪(XRD)对BC-YP及BC-DZ进行检测,研究苹果渣水解液作为发酵培养基原料对BC性能的影响。

1.3 数据处理方法

所有数据均用三次平行实验的平均值表示,用SPSS(PASW Statistics18)软件对数据进行处理。方差分析及多重比较中p<0.05为显著差异,记为*。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 碳源对BC产量的影响 由图1可知,随着发酵培养基中所加入碳源质量浓度升高,BC产量呈先上升再下降的变化趋势。葡萄糖质量浓度低于30.00 g/L,蔗糖和乳糖质量浓度低于40.00 g/L时,BC产量随着糖浓度的增大呈上升趋势。之后BC产量反而降低。相同质量浓度水平下,蔗糖作为碳源时BC产量最大,其次分别是乳糖、葡萄糖。分析原因,主要有以下几个方面:苹果渣水解液中糖含量较低,所提供碳源不能满足产物的持续合成,因此随着外源碳源的加入量增大,BC产量随之提高;添加碳源量过高时,易引起培养基渗透压过高,反而抑制菌体细胞的生长及产物的合成,使BC产量降低;相较于蔗糖和乳糖,葡萄糖为微生物的快速利用碳源。高质量浓度葡萄糖的快速利用,容易引起糖代谢途径中丙酮酸的积累及无氧酵解产物乳酸、醋酸等的产生,使发酵液pH降低,不利于细胞的生长及产物的合成[11]。同时快速利用基质的利用易产生对产物合成相关酶的阻遏作用,不利于发酵过程由细胞生长期转为产物生产期,从而降低产物产量;蔗糖和乳糖作为碳源时,微生物对其水解速率不同,其利用速率也不相同。培养基中添加40.00 g/L的蔗糖比相同质量浓度的乳糖发酵产BC产量高,可能是因为木醋杆菌Acetobacterxylinum在代谢过程中将蔗糖水解为葡萄糖及果糖,其代谢及利用速率更适宜于产物BC的合成,因而可促进BC的合成。因此选择蔗糖质量浓度40.00 g/L为较佳参数。

图1 碳源种类及质量浓度对BC产量的影响Fig.1 Effect of carbon source’s types and mass concentration on BC productivity

2.1.2 氮源对BC产量的影响 由图2可知,发酵培养中分别加入牛肉膏、麸皮、蛋白胨作为氮源时,随着氮源质量浓度的升高,BC产量呈先上升再下降的趋势,其最大产量对应氮源质量浓度均为10.00 g/L。表明苹果渣水解液中缺乏微生物合成BC所需蛋白质,需要外源添加氮源,最适添加量10.00 g/L。氮源添加量继续增加时,发酵培养基中氮源的质量浓度过高,易引起菌体细胞生长速率过快,不利于发酵过程由细胞生长期转为产物生产期,从而降低BC产量。所添加三种氮源中,蛋白胨作为氮源时,BC产量最高,可达6.51 g/L,表明蛋白胨为木醋杆菌发酵生产BC最佳氮源。因此选择蛋白胨质量浓度10.00 g/L为较佳参数。

图2 氮源种类及质量浓度对BC产量的影响Fig.2 Effect of nitrogen source’s types and mass concentration on BC productivity

2.1.3 无机盐对BC产量的影响 由图3可知,培养基中MgSO4质量浓度为1.00 g/L时,BC产量最高达6.86 g/L。Mg2+是微生物代谢过程中多种酶的辅基,如大部分核酸复制转录相关酶均需Mg2+保证其催化活性,因此,发酵培养基中添加合适浓度的Mg2+,对BC的合成具有促进作用。这与Son等人的研究结果一致[14]。同时,发酵培养基中K2HPO4的加入并没有对BC的合成表现出促进作用,BC产量反而有所降低,分析原因,可能是培养基中过量的磷酸盐对糖代谢过程中戊糖磷酸途径产生了抑制作用,从而抑制BC的合成。培养基中柠檬酸钠的加入对BC产量影响不大。因此培养基中无机盐选择硫酸镁进行进一步研究。

图3 无机盐种类及质量浓度对BC产量的影响Fig.3 Effect of inorganic salt's types and mass concentration on BC productivity

2.1.4 PDE抑制剂对BC产量的影响 由图4可知,发酵培养基中黄嘌呤和咖啡因的加入对BC的合成具有明显的促进作用,添加黄嘌呤质量浓度为0.90 g/L,咖啡因质量浓度为0.70 g/L时,BC产量可分别提高14.2%,5.7%。BC生物合成过程中,纤维素合成酶在环鸟苷酸(C-di-GMP)的激活下能够保持较高活性,C-di-GMP又能被磷酸二酯酶(PDE)水解为无活性的线状鸟苷酸,因此理论上PDE抑制剂能够促进BC的合成。咖啡因、黄嘌呤和茶碱等可抑制PDE的活性[15],使C-di-GMP在细胞内保持较高水平,提高纤维素合成酶活性,从而提高BC的合成速度。实验结果与理论分析一致。培养基中PDE抑制剂选择黄嘌呤进行进一步研究。

图4 PDE酶抑制剂对BC产量的影响Fig.4 Effect of PDE inhibitor on BC productivity

2.2 响应面优化发酵培养基配方

2.2.1 响应面实验设计及结果 综合单因素实验结果,进一步对蔗糖、蛋白胨、硫酸镁及黄嘌呤质量浓度4个因素进行优化。以这4个因素为自变量,以BC产量为响应值,根据Box-Behnken实验设计原理,设计中心组合实验,实验结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计与结果

2.2.2 响应面分析 利用Design Expert 7.0 软件对二次回归模型进行规范分析,蔗糖、蛋白胨、硫酸镁及黄嘌呤质量浓度之间交互作用对BC产量的影响见图5。

结合表3所示方差分析结果,由图5所示响应面曲线3D图及等高线图分析可知[16]:硫酸镁与蔗糖、硫酸镁与蛋白胨、黄嘌呤与硫酸镁对BC产量影响的交互作用较强。同时由图可知,蔗糖、硫酸镁、黄嘌呤对BC产量的影响比较显著,曲线较陡;而蛋白胨对BC产量的影响相对较小,曲线较平缓,其数值的增加减少,对响应值的变化影响较小。

2.2.3 最佳发酵培养基 由Design 软件求出回归模型极值点,对应的最佳发酵培养基组分为:蔗糖质量浓度38.44 g/L、蛋白胨质量浓度10.91 g/L、硫酸镁质量浓度0.85 g/L、黄嘌呤质量浓度0.87 g/L,此条件下,BC的理论产量为7.31 g/L。为检验响应面法的可靠性,在最佳培养基条件下进行验证实验。此条件下进行3次平行实验,BC平均产量为(7.19±0.15)g/L,与理论值的相对误差为1.6%。说明回归方程能比较真实地模拟各因素对BC产量的影响,因此,使用该回归模型优化利用酒糟水解液发酵生产BC的培养基是可行的。

2.3 发酵产物的结构与性能

表3 回归方程方差分析结果

图5 交互因素对BC产量的影响响应面曲线图Fig.5 Response surface plots showing the effects of interactions of factors on the yield of BC

注:** 差异极显著,p<0.01;* 差异显著,p<0.05。

酒糟水解液发酵BC(BC-YP)与基本培养基发酵BC(BC-DZ)红外图谱如图6所示。吸收峰3285、1154、1077、1040 cm-1证实了样品中大量-OH的存在;吸收峰2925、1383、645 cm-1证实了-CH2-、-CH-和C-H的存在;吸收峰1241 cm-1证实了环C-O-C的存在;吸收峰1241、1033 cm-1证实了直链C-O-C的存在[17-18]。以上结果显示为细菌纤维素葡聚糖的特征吸收,可以推断出两种样品的主要成分均为细菌纤维素。由图6可知,BC-YP和BC-DZ红外图谱基本一致,说明两种样品的化学组成非常相似,苹果渣水解液作为发酵原料不影响BC的化学结构。

图6 基本培养基发酵BC(BC-DZ)与苹果渣水解液发酵BC(BC-YP)红外图谱Fig.6 FT-IR of BC produced from basic medium(BC-DZ) and BC from pomace hydrolysate (BC-YP)

苹果渣水解液发酵BC(BC-YP)与基本培养基发酵BC(BC-DZ)XRD图谱如图7所示。由图可知,BC-YP 和BC-DZ的X-射线图谱大致相同,且在相同位置处均含有主要衍射峰,分别在14.8°、16.8°和21.7°附近存在三个衍射峰,此三个峰分别对应纤维素晶体的<101>、<101>和<002>晶面[19],据此可知BC-YP 和BC-DZ为Ⅰ型纤维素。

图7 基本培养基发酵BC(BC-DZ)与苹果渣水解液发酵BC(BC-YP)XRD图谱Fig.7 XRD of BC produced from basic medium(BC-DZ) and BC from pomace hydrolysate (BC-YP)

两种样品的结晶度与晶体粒径的结果如表4所示。结果表明,BC-YP 和BC-DZ的结晶度基本相同,均为24%左右,BC-YP 粒径大于BC-DZ。结晶度与纤维的抗张强度、杨氏模量、硬度、伸长率、吸湿性、润胀度、柔软性等性质有一定的关系[20-21],说明苹果渣水解液作为发酵原料不影响BC结晶度。晶体粒径与透明度、撕裂因子有关,苹果渣水解液中含有纤维素未水解完全的多糖成分,部分多糖可在BC合成过程中结合到BC中,从而改变BC的晶体粒径。

表4 基本培养基发酵BC(BC-DZ)与苹果渣水解液发酵BC(BC-YP)XRD结果

注:BC-DZ-基本培养基发酵BC;BC-YP-苹果渣水解液发酵BC。

3 结论

通过单因素实验和响应面法对苹果渣水解液发酵生产BC的发酵培养基进行优化,建立了蔗糖、蛋白胨、硫酸镁和黄嘌呤4个因素对BC产量的二次回归方程模型,经检验,模型准确有效,可以用该模型分析预测各因素对BC产量的影响。由单因素实验和响应面优化模型确定利用苹果渣水解液发酵生产BC的最佳发酵培养基为:蔗糖38.44 g、蛋白胨10.91 g、硫酸镁0.85 g、黄嘌呤0.87 g、乙醇10 mL、苹果渣水解液1000 mL、pH6.0。在此条件下,得到BC产量为7.19 g/L,较优化前(5.65 g/L)提高了27.3%。利用FT-IR及XRD对发酵产物BC化学基团、结晶性能进行了比较,结果表明,苹果渣水解液发酵产物BC结构性能与基本培养基发酵产物BC基本一致,苹果渣水解液能够替代部分发酵原料发酵生产BC,且不影响BC性能。

[1]Sybele S,Lucas N T,Paulo T O,et al. Bacterial cellulose-collagen nanocomposite for bone tissue engineering[J]. J. Mater. Chem,2012,22,22102-22112.

[2]Cai Zhi-jiang,Yang Guang. Bacterial Cellulose/Collagen Composite:Characterization and First Evaluation of Cytocompatibility[J]. J. Appl. Polym. Sci.,2011,120,2938-2944.

[3]赵思雨,陈仕艳,王华平. 细菌纤维素的生产及其在食品工业中的应用[J]. 湛江师范学院学报,2013,34(6):69-72.

[4]杨福有,祁周约,李彩风杨,等. 苹果渣营养成分分析及饲用价值评估[J]. 甘肃农业大学学报,2000,35(3):340-344.

[5]Sargent S A.An energy and cost analysis modelto evaluate the combustion of food processing wastes[D].Ph.D. Thesis,Department of Agriculture Engineering,Michigan State University,E. Lansing,MI. 1984.

[6]李彩凤,杨福有. 苹果渣的营养成分及利用[J].饲料博览,2001(2):38

[7]Joshi V K,Sandhu D K.Properation and Evaluation of Animal Feed Byproduct Produced by Solid-State Fermentation of Apple Pomace[J]. Bioresource Technology,1996,56:251-255.

[8]Joshi V K,Gupta K.Production and evaluation off ermented apple pomace in the feed of broilers[J].Journal of Food Science and Technology,2 000,37(6):609-612.

[9]Sandhu D K,Joshi V K. Solid state fermentation of apple pomace for concentation of ethanol and animal feed[J]. Jounral of Science &Industrial Research,1997,56(2):86-90.

[10]史红兵,宋纪蓉,黄洁,等. 果渣制备可溶性膳食纤维的工艺研究[J].西北大学学报(自然科学版),2004(4):148-152.

[11]张雯,齐香君. 细菌纤维素生产菌株菌体细胞收集方法的研究[J]. 食品工业科技,2006,27(9):57-58.

[12]Chao Y,Ishida T Y,Shoda M. Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum in a 50-L internal-loop airlift reactor[J].Biotechnology Bioeng,2000,68:345-352.

[13]Putra A,Kakugo A,Furukawa H,et al. Tubular bacterial cellulose gel with oriented fibrils on the curved surface[J]. Polymer,2008,49:1885-1891.

[14]Son HJ.,Kim HG.,Kim KK.,et al. Increased production of bacterial cellulose by Acetobacter sp V6 in synthetic media under shaking culture conditions[J]. Bioresource Technology,2003,86(3),215-219.

[15]章国燕,张奕华. 选择性磷酸二酯酶Ⅳ抑制剂的研究[J].药学进展,2002,26(2):86-91.

[16]Sarya A,Pierre D,Selim K. Lipase-catalyzed transesterification of krill oil and 3,4-dihydroxyphenyl acetic acid in solvent-free medium using response surface methodology[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2012,84(212):189-197.

[17]张丽平,卢红梅,彭湘屏,等. 淋浇发酵法生产细菌纤维素的结构与性质研究[J]. 食品工业科技,2012,33(22):197-201.

[18]Rajalaxmi D,Marcus F,Arthur J R. Improving the mechanical and thermal properties of gelatin hydrogels cross-linked by cellulose nanowhiskers[J]. Carbohydrate Polymers,2013(91):638-645

[19]Pei Ying,Yang Juan,Liu Pan,et al. Fabrication,properties and bioapplications of cellulose-collagen hydrolysate composite films[J]. Carbohydrate Polymers,2013,92:1752-1760.

[20]Saska S,Barud H S,Gaspar A M M,et al. Bacterial Cellulose-Hydroxyapatite Nanocomposites for Bone Regeneration[J]. International Journal of Biomaterials,2011,5(5):1605-1613.

[21]冯劲,施庆珊,冯静. 不同干燥方式对细菌纤维素物理性能的影响[J],现代食品科技,2013,29(9):2225-2101.

Optimization of medium for bacterial cellulose fermentation with pomace by response surface methodology and property studies of the product

ZHANG Wen1,LI Hong-Jie2,LIU Lan1,QI Xiang-Jun1

(1.School of Food and biological engineering,Shaanxi University of Science & Technology,Xi’an 710021,China；2.Huadong Pharmaceutical Co.,Ltd.,Hangzhou 311000,China)

In order to increase the bacterial cellulose(BC)productivity ofAcetobacterxylinumusing pomace hydrolysate,response surface methodology was used to optimize the fermentation medium. Meanwhile,the properties of BC were compared through fourier transform infrared(FT-IR)and X-ray diffraction(XRD). According to the results of single factor experiments and response surface experiments,the optimal fermentation medium were determined as follows:saccharose 38.44 g,peptone 10.91 g,magnesium sulfate 0.85 g,xanthine 0.87 g,ethanol 10 mL,pomace hydrolysate 1000 mL and pH6.0,under these conditions,the BC productivity was 7.19 g/L,increased by 27.3% in comparision to before(5.65 g/L). The properties and structures of BC produced with pomace hydrolysate were confirmed to be basically same with BC produced with basic medium,which indicated that the pomace hydrolysate could be used as part of raw materials to ferment BC and would not affect the properties of BC.

pomace;bacterial cellulose;medium optimization;response surface methodology

2015-03-12

张雯(1982-)，女，博士，副教授，研究方向:生物制药，E-mail:zwen102@163.com。

陕西省科技厅自然基金项目(2012JM2005)；陕西省教育厅科研专项项目(15JK1108)；2013年国家级大学生创新创业训练计划项目(201310708014)；西安市科技计划项目(CXY1513(3))。

TS201.1

B

1002-0306(2015)23-0228-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.039