松针多糖微波提取工艺及抗氧化性研究

许小向,洪艳平,胡捷敏,上官新晨,,*,陆 庆,邹 凯

(1.江西省天然产物与功能食品重点实验室,江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌 330045;2.江西省食品药品监督管理局,江西南昌 330045)

松针多糖微波提取工艺及抗氧化性研究

许小向1,洪艳平1,胡捷敏2,上官新晨1,2,*,陆 庆1,邹 凯1

(1.江西省天然产物与功能食品重点实验室,江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌 330045;2.江西省食品药品监督管理局,江西南昌 330045)

采用微波辅助法对松针多糖提取工艺进行了研究,通过考察提取温度、提取时间、提取功率和料液比对松针多糖得率的影响,在单因素实验基础上进行正交优化,确定了提取的最佳工艺参数为:提取温度90 ℃、提取时间10 min、提取功率800 W、料液比1∶14(g·mL-1),提取两次,在优化条件下松针多糖的提取得率最高达2.1698%;此外,通过测定松针多糖还原能力、清除自由基的能力评价了其抗氧化活性,结果表明,松针多糖具有一定的抗氧化能力,对DPPH、·OH、ABTS+·的半抑制浓度(IC50)分别为0.291、1.793、0.617 mg/mL。

松针,多糖,微波提取,抗氧化性

松针(Pine needle),松科松属植物的针状叶,我国资源较为丰富。研究发现[1-2],松针中含有蛋白质、脂肪、多糖、纤维素、叶绿素、萝卜素以及多种氨基酸、维生素和矿物元素等,营养丰富,具有提高动物免疫力等功效,开发的产品有松针茶、松针精油、松针粉等。近年来大量研究表明[3-4],植物多糖是一种具有多种生理功能和开发价值的活性多糖,对人体有独特的保健功效,许多植物多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗感染、抗溃疡等多种生理功能。浙江中医学院药理所研究发现松针具有显著抗基因突变、抗DNA损伤、提高小鼠SOD活性及降血脂等作用,说明松针中含有清除自由基的活性成分[5],如松针黄酮、多糖等。目前,已有相关文献研究了松针多糖的提取工艺,徐丽珊[6]等采用水提法对湿地松中松针多糖的提取工艺进行了研究,许丽丽等[7]采用超声波辅助法研究了马尾松松针多糖的提取工艺,但关于松针多糖抗氧化性方面的研究报道甚少。本文采用微波辅助法提取马尾松中的松针多糖,克服了水提法耗时长、成本高等缺点,并研究其抗氧化活性,为松针多糖在食品、药品、饲料等领域的进一步研究开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马尾松 校园采摘;无水乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、邻苯三酚、三氯乙酸、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS+)、过硫酸钾等 分析纯。

RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHZ-Ⅲ型循环真空泵 上海亚荣生化仪器厂;Q-350B3型高速粉碎机 上海冰都电器有限公司;FA2104V型电子天平 上海青浦仪器有限公司;XH-100B型祥鹄电脑微波催化合成萃取仪 北京祥鹄科技发展有限公司;V-5600型可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;TDL-5A型低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂;ZD-A30普通型真空冷冻干燥机 上海安亭科学仪器厂;电热恒温鼓风干燥箱 上海福玛设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取工艺流程 松针→除杂→干燥→粉碎→石油醚回流脱脂脱色2次(2 h/次)→95%乙醇回流处理→烘干→微波辅助水提取→抽滤→滤液减压浓缩→5倍体积95%乙醇沉淀12 h→4000 r/min离心15 min→沉淀物→无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤→水复溶→Sevage法除蛋白5次→蒸馏水4 ℃透析48 h→冷冻干燥→多糖粗品。

1.2.2 标准曲线的制备 精确称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品20 mg于500 mL容量瓶中,蒸馏水定容,制得质量浓度为40 μg/mL的葡萄糖标准对照液。分别取其0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于试管中,加蒸馏水补至2.0 mL,再各加入6%苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL,摇匀冷却,以蒸馏水做空白对照,室温放置20 min后在490 nm处测定其吸光值[8]。

1.2.3 松针多糖提取得率的测定 称取5.0 g松针粉按1.2.1方法制成提取液,定容至250 mL,准确移取VmL按1.2.2方法测定其吸光值(A),根据下面公式计算多糖提取得率:

多糖提取得率(%)

1.2.4 微波提取工艺条件优化 称取5.0 g松针粉若干份,分别选取不同提取温度(65、70、75、80、85、90、95 ℃)、提取时间(6、8、10、12、14、16 min)、提取功率(300、400、500、600、700、800、850 W)、料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶20、1∶25、1∶30(g·mL-1))进行单因素实验,根据1.2.3方法计算出的结果比较不同条件下对松针多糖提取得率的影响。在单因素实验基础上,以多糖提取得率为考察指标,选取L9(34)正交设计以确定提取松针多糖的最佳工艺参数,因素水平设计见表1,正交实验结果重复两次。在正交优化条件下进行提取次数实验。

1.2.5 松针多糖的抗氧化性实验

1.2.5.1 清除DPPH自由基的能力测定 在试管中加入不同质量浓度的松针多糖水溶液及等体积的0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液,混匀后于暗处静置30 min,以无水乙醇做参比,在波长517 nm处测定其吸光度[9-10]。平行测定3次,取平均值。以VC做阳性对照,比较松针多糖与VC对DPPH自由基的清除效果。清除率计算公式为:

清除率(%)=1-(A2-A1)/A0×100

式中:A0-2 mL DPPH溶液+2 mL无水乙醇;A1-2 mL无水乙醇+2 mL样品溶液;A2-2 mL DPPH溶液+2 mL样品溶液。

表1 正交实验因素水平表

1.2.5.2 清除羟基自由基的能力测定 反应体系中加入不同质量浓度的样品液、6 mmol/L H2O2、6 mmol/L FeSO4、6 mmol/L水杨酸各2 mL,其中水杨酸最后加入启动整个反应,37 ℃水浴30 min后,5000 r/min离心5 min,以蒸馏水为参比,在510 nm下测定吸光度[11-12]。平行测定3次,取平均值。以VC做阳性对照,比较松针多糖与VC对羟自由基的清除效果。清除率计算公式为:

清除率(%)=1-(A1-A2)/A0×100

式中:A0-2 mL H2O2+2 mL FeSO4+2 mL水杨酸+蒸馏水;A1-2 mL样品液+2 mL H2O2+2 mL FeSO4+2 mL水杨酸;A2-2 mL样品液+2 mL H2O2+2 mL FeSO4+蒸馏水。

清除率(%)=1-(A1-A2)/A0×100

清除率(%)=(A0-Ai)/A0×100

1.2.5.5 还原能力的测定 取2.0 mL不同浓度样品溶液于试管中,加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液2.5 mL(pH6.6)和1%的铁氰化钾溶液2.5 mL,混匀后于50 ℃水浴中反应20 min后,快速冷却,再加入10%三氯乙酸(TCA)2.0 mL,混匀,4000 r/min离心10 min,移取上清液2.5 mL于试管中,加入0.1%的三氯化铁溶液0.5 mL、蒸馏水2.5 mL,充分混匀常温反应5 min后于700 nm处测定其吸光值A,吸光值越大表示还原能力越强[15];以水为空白,各组平行测定3次,取平均值。以VC做阳性对照,比较松针多糖与VC的还原能力。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线

在实验条件下,以吸光度为横坐标,葡萄糖质量为纵坐标,制作标准曲线。通过线性回归得出方程为y=0.01051x+0.0228,相关系数r=0.9997,线性关系良好,结果如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 微波提取松针多糖单因素实验结果

不同提取温度、提取时间、微波功率、料液比对松针多糖提取得率的结果如图2所示:

图2 温度、时间、微波功率、料液比对松针多糖提取得率的影响Fig.2 Effect of temperature,time,microwave power,solid to solvent ratio on extraction of pine needle polysaccharide

2.2.1 提取温度对松针多糖提取得率的影响 结果由图2A可知:随着提取温度的升高,松针多糖提取得率逐渐上升,当温度达90 ℃时,多糖提取得率最高,当温度高于90 ℃时,多糖提取得率随温度的升高而降低,这可能是由于较高的温度易于细胞壁破碎而使活性多糖溶出,但温度过高可能容易导致多糖糖苷键断裂而失活,使得提取出的多糖减少[16],故选择90 ℃为最佳提取温度。

2.2.2 提取时间对松针多糖提取得率的影响 结果由图2B可知:在一定范围内,随着提取时间的延长,多糖提取得率明显增加,在12 min时达到最大,继续延长时间提取得率下降,可能是因为多糖分子在高温条件下时间过长,使得部分多糖降解为单糖,从而影响其提取得率,故提取时间不宜过长,选择12 min为最佳。

2.2.3 微波功率对松针多糖提取得率的影响 结果由图2C可知:微波功率在300～800 W范围内,随着微波功率的增大,多糖提取得率不断增加,在800 W时达到最大,但继续增大功率,多糖提取得率明显降低,这可能是由于微波功率太大、辐射过强导致温度过高使得部分多糖被分解,从而影响其提取得率,故选择800 W为最佳提取功率。

2.2.4 料液比对松针多糖提取得率的影响 结果由图2D可知:多糖提取得率随着料液比的增大呈先增后减的趋势,这可能在于溶剂用量影响有效成分浸出液的浓度,从而影响原料内部与外部之间提取成分的传质过程。在料液比很小时,短时间内多糖的溶出就达到平衡,不利于多糖的进一步溶出,但料液比太大受溶解度的约束作用变小,且水量过多导致后续蒸发困难,而底物浓度过低使得提取得率呈现下降趋势[17],故料液比选择1∶14最佳。

2.3 正交实验结果分析

松针多糖微波提取正交实验方案与结果如表2所示。

表2 正交实验设计与数据处理表

表3 正交设计方差分析表

注:F0.05(2,8)=19.37;F0.01(2,8)=99.36。

由表2、表3分析可知,各因素对松针多糖提取得率影响的主次为A(温度)>C(功率)>D(料液比)>B(时间),提取温度对松针多糖提取的影响极显著,提取功率对松针多糖提取的影响显著,而提取时间和料液比对松针多糖提取的影响不显著。综合极差分析、方差分析和正交实验结果可确定最佳的条件组合为A3B2C3D2，但因素B对结果影响最小，因此从节约时间角度考虑，最终选取1水平，即提取温度90 ℃、提取时间10 min、提取功率800 W、料液比1∶14 g·mL-1。在此工艺条件下进行提取级数实验,重复三次取平均值。结果由表4可知,前两次的提取得率占三次提取的99.7%,故提取两次,且两次提取得率平均达2.1698%。

表4 提取次数结果

2.4 松针多糖的紫外扫描

取适量除蛋白后的多糖,配成一定浓度的水溶液,在220～700 nm范围内进行紫外光谱扫描。结果如图3所示:在260 nm和280 nm处,松针多糖均未发现有明显的特征吸收峰,表明其中不含核酸、多肽和游离蛋白等物质。

图3 松针多糖的紫外光谱Fig.3 Ultraviolet spectrum of pine needle polysaccharide

2.5 松针多糖的抗氧化性实验结果

2.5.1 清除DPPH自由基能力的测定 DPPH自由基是一种稳定的含氮自由基,结构中存在单电子,在乙醇溶液中显深紫色,在517 nm处有特征吸收;加入抗氧化剂后,DPPH与抗氧化剂中的氢结合,溶液颜色发生改变,通过测定吸收减弱的程度来评价清除其自由基能力的强弱[18]。按1.2.5.1方法实验,计算不同质量浓度的松针多糖和VC对DPPH自由基的清除率,结果由图4可知,VC对DPPH自由基有较强的清除作用,0.1 mg/mL的VC清除率即可达到90%以上;松针多糖对DPPH自由基有较好的清除能力,在多糖质量浓度为0.2～2.0 mg/mL范围内呈量效关系,清除率最高达86.84%,清除DPPH自由基能力稍弱于VC。用SPSS软件分析数据得出松针多糖对DPPH自由基的半抑制浓度(IC50)为0.291 mg/mL。

图4 松针多糖和VC对DPPH自由基清除率的影响Fig.4 DPPH radical-scavenging activities of pine needle polysaccharide and VC

2.5.2 清除羟自由基能力的测定 FeSO4与 H2O2反应会生成羟自由基,·OH具有很高的反应活性,存活时间短,在体系中加入水杨酸后能有效捕捉·OH,并产生有色物质,该有色物质在510 nm处有最大吸收;多糖溶液加入后会与水杨酸竞争羟自由基,使颜色变浅或消失,从而判定其清除羟自由基的能力[19]。按1.2.5.2方法实验,计算不同质量浓度的松针多糖和VC对·OH的清除率,结果由图5可知,松针多糖和VC对·OH都有较好的清除率,松针多糖随着质量浓度的增大,清除率不断增加,当质量浓度为2.0 mg/mL时,松针多糖对羟自由基的清除率达55.96%,VC对羟自由基的清除率最高达99.54%,用SPSS软件分析数据得出松针多糖对羟自由基的IC50为1.793 mg/mL。

图5 松针多糖和VC对·OH清除率的影响Fig.5 OH radical-scavenging activities of pine needle polysaccharide and VC

图6 松针多糖和VC对·清除率的影响Fig. · radical-scavenging activities of pine needle polysaccharide and VC

2.5.4 清除ABTS+自由基能力的测定 ABTS在反应体系中被氧化后会生成稳定的ABTS+自由基,为蓝绿色,在734 nm处有特征吸收。加入自由基清除剂后会使颜色减弱,吸光度下降,从而反映清除其自由基的能力[21]。按1.2.5.4方法实验,计算不同质量浓度的松针多糖和VC对ABTS+自由基的清除率,结果如图7所示,VC的质量浓度为0.1 mg/mL时清除率即可达到90%以上,表明VC对ABTS+自由基有较强的清除能力;松针多糖对ABTS+自由基的清除率随着质量浓度的增大而不断增大,最高达71.24%,用SPSS软件分析数据得出松针多糖对ABTS+自由基的IC50为0.617 mg/mL。

图7 松针多糖和VC对ABTS+自由基清除率的影响Fig.7 ABTS+ radical-scavenging activities of pine needle polysaccharide and VC

2.5.5 还原能力的测定 铁氰化钾在还原性物质作用下被还原为亚铁氰化钾,酸性条件下亚铁氰化钾可与Fe3+反应生成在700 nm下具有特征吸收的普鲁士蓝,生成的普鲁士蓝浓度越大,则其吸光值越大,即还原能力越强。物质还原力与其抗氧化性呈明显的相关性,还原力越强,也就是抗氧化性越强[22]。具有抗氧化性的多糖和VC将铁氰化钾还原成亚铁氰化钾后,与Fe3+作用生成普鲁士蓝溶液浓度的高低则可反映物质抗氧化能力的强弱。按1.2.5.5方法实验,计算不同质量浓度的松针多糖和VC的还原能力,由图8可以看出:VC具有较强的还原能力,松针多糖的还原力在一定质量浓度范围内随浓度的增大而提高,且呈现明显的量效关系,表明松针多糖具有一定的抗氧化能力,但在测定的浓度范围内,其还原力低于VC。

图8 松针多糖和VC的还原能力Fig.8 Ferric reducing antioxidant power of pine needle polysaccharide and VC

3 结论

采用微波辅助法对松针多糖的提取工艺进行研究,考察提取温度、提取时间、提取功率和料液比对松针多糖提取得率的影响,在单因素实验基础上进行正交实验优化得到最佳微波辅助提取工艺为:提取温度90 ℃、提取时间10 min、提取功率800 W、料液比1∶14(g·mL-1),提取两次,优化条件下松针粗多糖提取得率最高达2.1698%。该方法实用可靠,可用于松针多糖的提取。

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Study on microwave extraction technology and antioxidant activity of Pine needle polysaccharose

XU Xiao-xiang1,HONG Yan-ping1,HU Jie-min2,SHANG GUAN Xin-chen1,2,*,LU Qing1,ZOU Kai1

(1.College of Food Science and Engineering,Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Food,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;2.Jiangxi provincial food and Drug Administration,Nanchang 330045,China)

The microwave-assistant extraction technology and antioxidant activity of pine needle polysaccharose were studied. The effects of extraction temperature,extraction time,microwave power and solid-liquid ratio on pine needle polysaccharose content were investigated. After single factor experiments,the orthogonal test was carried out to determine the optimum process parameters. The results indicated that the best extraction process conditions were as follows:extraction temperature 90 ℃,extraction time 10 min,microwave power 800 W,solid-liquid ratio 1∶14(g·mL-1). Under optimal conditions,the extraction rate of pine needle polysaccharides up to 2.1698% through extracting two times. Moreover,the antioxidant activity of Pine needle polysaccharose was explored using reduction and free radical scavenging reactions. The results showed that pine needle polysaccharose had an obvious antioxidant activity,the IC50value of DPPH,·OH and ABTS+was 0.291,1.793,0.617 mg/mL,respectively.

Pine needle;polysaccharide;microwave extraction technology;antioxidant activity

2015-02-12

许小向(1990-),女,硕士,研究方向:食品科学,E-mail:18770046825@163.com。

*通讯作者:上官新晨(1962-),男,博士,教授,研究方向:植物资源开发与利用,E-mail:shangguanxc-818@sina.cn。

国家科技支撑计划(2013BAD10B04-3);江西省高等学校科技落地计划(No.KJLD12021)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)23-0222-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.038