响应面法优化马奶酒对沙门氏菌抑菌效果发酵条件的研究

韩 磊,殷文政,岳智慧

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

响应面法优化马奶酒对沙门氏菌抑菌效果发酵条件的研究

韩 磊,殷文政*,岳智慧

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

实验中以新鲜马奶作为原料,通过单因素实验探讨了发酵温度、发酵时间、乳酸菌和酵母菌接种量及接种比例等发酵条件对马奶酒抑菌效果的影响,并进一步通过响应面分析对马奶酒抑菌效果的最佳发酵条件进行优化。结果表明,马奶酒最佳抑菌效果出现在发酵温度33 ℃、发酵时间89 h、接种比例为5.6%∶2.4%。在此条件下,马奶酒抑菌圈直径理论值为17.794 mm,实验验证值17.70 mm,相对误差为0.53%,说明响应面优化后得到的马奶酒抑菌效果真实可靠。

马奶酒,抑菌效果,响应面分析,发酵条件

马奶酒是蒙古族饮食文化中的重要部分,时至今日各地都保留着马奶酒的制作工艺。马奶具有非常高的营养价值和研究价值,并且含有人体不可或缺的氨基酸和脂肪酸[1]。马乳非常接近人乳,马乳蛋白易于消化,马乳作为消化不良的婴幼儿及成人的乳用品,可以起到良好的营养和保健作用[2-3]。沙门氏菌是一类寄生于人类和动物肠道内的一种革兰氏阴性杆菌,一些沙门氏菌如鼠伤寒沙门氏菌、肠沙门氏菌肠亚种是引起人类食物中毒主要病原菌。在中国,由沙门氏菌引起的病原微生物爆发事件位居第二,仅次于副溶血性弧菌[4]。成熟的马奶酒对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单核增生李斯特菌有明显的抑制作用[5],而且马奶酒中所产的抑菌物质多种多样,其中主要以酸类、醇类和细菌素为主,尤其可以抑制一些病原菌和腐败菌[6-7]。在内蒙古自治区呼伦贝尔、锡林郭勒盟蒙医医院都可以见到将酸马奶酒作为辅助治疗饮料治疗呼吸系统、胃肠道疾病的现象。

目前,有很多关于利用响应面法优化乳酒和果酒发酵条件的研究[8-11],其中采用响应面法优化马奶酒抑菌效果和马奶酒抑制肠沙门氏菌的研究较少。因为酸马奶酒本身具有一定的营养及医疗价值,为了充分开发利用内蒙古马奶产业,本实验以分离于蒙古国酸马奶中的乳酸菌和酵母菌为发酵菌种,以肠沙门氏菌肠亚种为指示菌,以鲜马奶为原料,结合单因素实验和响应面分析软件确定马奶酒抑制肠沙门氏菌的最佳发酵条件,为内蒙古马奶酒研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜马奶 锡林郭勒地区:乳酸菌、酵母菌 分离于蒙古国地区酸马奶:指示菌 肠沙门氏菌肠亚种1.1859(Salmonellaentericasubsp.enterica)购于中国科学院普通微生物菌种保藏管理中心。

MRS培养基(g/L) 葡萄糖20、蛋白胨10、牛肉膏10、酵母膏5、柠檬酸二胺2、磷酸氢二钾2、乙酸钠5、硫酸镁0.58、硫酸锰0.25、吐温-80 1 mL和蒸馏水 1000 mL;酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(g/L) 酵母膏10、蛋白胨20、葡萄糖20、蒸馏水1000 mL;营养肉汤培养基(g/L) 牛肉膏3、蛋白胨10、氯化钠5、琼脂15、蒸馏水1000 mL。

HFsafe-900手动型生物安全柜 上海力新仪器有限公司:梅特勒PB-10 pH计 梅特勒托利多公司:KDC-140HR高速冷冻离心机 河南兄弟仪器设备有限公司:BCN-1360B生物洁净工作台 苏净安泰技术有限公司:KG-SX-500高压蒸汽灭菌器 日本Tomy Digital Biology公司:HZQ-X100振荡培养箱 华城敏科实验仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 分析测定方法 酸度测定:酸碱滴定法进行测定(以乳酸计);糖含量测定:参考GB/T 23546-2009S《奶酒》进行测定;酒精度测定:使用酒精计进行测定[12];抑菌效果测定:牛津杯打孔平板法进行测定。

1.2.2 酸马奶加工工艺流程 新鲜马奶→4层纱布过滤→杀菌(90～95 ℃,保持45 s)→冷却→接种乳酸菌和酵母菌→发酵(120 r/min恒温培养)→装罐→成品

1.2.3 操作要点 鲜马奶原料需新鲜采集,且无腐败气味,无任何添加剂,新鲜的马奶需要通过过滤处理,将其中的一些杂质去除,加热杀菌后冷却至常温。指示菌经过活化之后接种于指示菌培养基中,37 ℃培养24 h,6500 r/min离心收集菌体配制成待测菌液,测定活菌数,以生长量在107cfu/mL的培养液为指示菌悬液。

采用牛津杯打孔法测定抑菌效果。取已经融化的琼脂水培养基10 mL倒入无菌平皿中,等待琼脂凝固后用灭菌镊子将8 mm牛津杯均匀放置到培养皿中,取指示菌菌液100 μL加入25 mL已融化的指示菌培养基中,充分震荡,等到培养皿中的培养基凝固后用镊子去除牛津杯,在孔径中加入200 μL已经发酵好的酸马奶,用游标卡尺准确测量抑菌圈直径(mm)[13]。

种子发酵液:将待测乳酸菌和酵母菌活化三代接种于培养基中,在适宜温度下培养24 h放入4 ℃冰箱待用[14]。母发酵液:灭菌处理后的鲜马奶按总接种体积5%接种乳酸菌和酵母菌发酵液,摇匀分别在38 ℃和30 ℃培养24 h和48 h。

1.2.4 发酵条件优化

1.2.4.1 单因素实验 以接种量4%∶4%[10](乳酸菌/酵母菌),发酵时间96 h筛选发酵温度,发酵温度分别为18、22、26、30、34、38、42 ℃。以接种量4%∶4%(乳酸菌/酵母菌),发酵温度34 ℃筛选发酵时间,选取的发酵时间分别为48、60、72、84、96、108、120 h。以发酵温度34 ℃,发酵时间84 h筛选接种量(乳酸菌/酵母菌),接种量分别为7%∶1%、6%∶2%、5%∶3%、4%∶4%、3%∶5%、2%∶6%、1%∶7%。通过测定抑菌活性、鲜马奶总酸度和总酒精度等指标对马奶酒进行考察。

1.2.4.2 响应面优化设计实验 结合单因素实验结果,根据Box-Behnken中实验设计,选择影响抑菌效果(Y)的3个因素:发酵温度(A)、发酵时间(B)、接种量(乳酸菌/酵母菌)(C)为自变量,利用Design-Expert软件对数据进行分析,根据其中的Box-Behnken实验组合设计进行3因素3水平实验。

表1 响应面实验的因素和水平编码值

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 不同发酵温度对发酵的影响 发酵温度是影响抑菌物质产生重要因素,在适宜的温度条件下,乳酸菌和酵母菌具有相互促进代谢产物生成的作用。乳酸菌主要进行苹果酸-乳酸发酵,酵母菌主要进行酒精发酵,当温度达到酵母菌适宜生长温度时,酵母菌通过利用乳酸盐进一步促进乳酸菌的生长和代谢[15]。所以在适宜的温度下,由于乳酸菌和酵母菌的活跃以及代谢产物的积累,马奶酒的抑菌效果会达到最佳。由表2可知,发酵温度由30 ℃上升至42 ℃时,温度逐渐达到乳酸菌最适生长温度,乳酸菌进行乳酸发酵,马奶酒的酸度显著升高(p<0.05)。当发酵温度在34 ℃时,马奶酒的抑菌效果达到17.36 mm,酒精度达到0.7%vol。当温度在38 ℃时抑菌效果和酒精度反而下降,说明过高的温度对马奶酒抑菌效果和酒精积累反而不利,因此选择34 ℃为最佳发酵温度。

表2 不同发酵温度对发酵的影响

2.1.2 不同发酵时间对酸马奶抑菌效果的影响 随着培养时间的延长,乳酸菌和酵母菌充分生长并且抑菌效果开始上升,同时酒精度和酸度也逐步上升,酒精和酸类物质对抑菌效果有一定的促进作用[16]。由表3可知,当培养时间由48 h增加到84 h时由于乳酸菌和酵母菌同步生长,抑菌效果和酒精度同时上升,84 h时抑菌圈直径和酒精度达到最大值,在84～96 h处抑菌效果达到最佳,酸度趋于平稳并保持在70 °T。在96 h之后酒精度积累量开始下降而酸度开始逐步上升,抑菌效果开始下降。这是由于发酵后期乳酸菌和酵母菌活性下降,导致乳酸菌和酵母菌代谢产物积累量的下降。因此选择抑菌圈和酒精度最大的84 h为最佳发酵时间。

表3 不同发酵时间对发酵的影响

2.1.3 不同接种量对发酵的影响 乳酸菌接种量是影响马奶发酵产抑菌物质的关键因素,也是影响马奶酸度的主要因素[15],适量的酵母菌可以与乳酸菌产生共生作用。在发酵初期乳酸菌接种量较高时,乳酸菌迅速生长并积累代谢产物,当酸度上升至一定水平时,乳酸菌的生长受到影响,这时酸度趋于平稳[17]。所以在乳酸菌高接种量7%∶1%和6%∶2%时酸度没有表现过高。由表4可知,当乳酸菌接种量和所占比例较小时,抑菌效果较差的同时酸度较低。随着乳酸菌接种比例增大,马奶酒的抑菌效果和酸度开始上升,当接种比例在4%∶4%、5%∶3%和6%∶2%时抑菌效果达到最佳。在接种量为4%∶4%时,因为酵母菌接种量较高,营养物质部分被用于酒精发酵,所以其酒精度为1.3%vol,其抑菌效果不如5%∶3%的17.56 mm。当乳酸菌接种比例达到6%∶2%时抑菌效果反而呈下降趋势,说明酵母菌接种比例较少时反而对抑菌物质的积累不利,因此选择接种量较为均衡且抑菌圈直径最大的5%∶3%为最适接种量。

2.2 酸马奶酒发酵响应面分析

综合以上单因素发酵结果,选取对抑菌效果影响较大的3个因素(发酵温度、发酵时间、接种量)作为主要因素,以Box-Behnken Design响应面分析法对其进行优化。表5为响应面实验设计及结果,由表5结果建立以马奶酒抑菌效果(Y)与发酵温度(A)、发酵时间(B)、接种量(C)的拟合方程。

Y=17.60-0.52A+0.63B+0.022C-0.31AB-0.23AC+0.28BC-1.72A2-0.93B2-0.27C2

表4 不同接种量对发酵的影响

表5 响应面实验设计及结果

表6 响应面结果及方差分析

注:“*”表示显著(p<0.05);“**”表示极显著(p<0.01)。

图1 发酵温度和发酵时间对抑菌圈直径影响的响应面图Fig.1 Response surface of fermentation temperature and fermentation time on the zone of inhibition effect

图2 发酵温度和接种量对抑菌圈直径影响的响应面图Fig.2 Response surface of fermentation temperature and inoculums on the zone of inhibition effect

图3 发酵时间和接种量对抑菌圈直径影响的响应面图Fig.3 Response surface of fermentation time and inoculums on the zone of inhibition effect

2.3 响应面图结果分析

利用Design-Expert软件对回归方程进行计算,做出交互项的三维响应面图及等高线图,比较各个变量之间的交互作用对响应值的影响。由图1～图3可知,马奶酒的抑菌效果随发酵时间与发酵温度的上升呈先上升后下降的趋势,发酵时间与发酵温度交互作用显著[20]。接种量变化对马奶酒的抑菌效果影响不明显,其曲线表现较为平滑,随着发酵温度的升高抑菌效果呈现先上升后下降的趋势,接种量与发酵温度的交互作用不显著。马奶酒的抑菌效果随发酵时间的延长呈先上升后下降的趋势,接种量与发酵时间交互作用显著。

2.4 马奶酒优化条件验证实验

对马奶酒的抑菌效果取最大值,用软件分析得到酸马奶的最佳发酵条件为:发酵温度33.16 ℃、发酵时间89.16 h、接种量(乳酸菌/酵母菌)5.61%∶2.39%,马奶酒的抑活性达到17.794 mm。为便于实际操作,发酵温度取33 ℃、发酵时间89 h、接种量5.6%∶2.4%。采用上述优化条件进行验证实验,马奶酒对肠沙门氏菌肠亚种抑菌效果为17.70 mm,相对误差为0.53%,说明该数学模型建立对酸马奶酒抑菌效果预测较为准确。

2.5 理化指标

马奶酒酒精度1.4%vol,总酸度110 °T,还原糖(以葡萄糖计)47.2 g/L,总酸(以乳酸计)7.0 g/L,符合国标中规定的标准[12]。

2.6 发酵菌及其它微生物指标

乳酸菌:3.2×107cfu/mL,酵母菌:4.5×104cfu/mL,大肠菌群:1个/25 mL,沙门氏菌及金黄色葡萄球菌均未检出。

3 结论

通过考察发酵温度、发酵时间、接种量(乳酸菌/酵母菌)等3个因素,以马奶酒对指示菌的抑菌圈直径为响应面值建立方程组和模型,预测出发酵温度33 ℃,发酵时间89 h,接种量(乳酸菌/酵母菌)5.6%∶2.4%。在此条件下发酵出的马奶酒抑菌圈直径为17.70 mm,马奶总酒精度为1.2%vol,说明该数学模型对马奶酒抑菌效果的预测准确可行,对马奶酒的研究具有一定的意义。

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Optimization of fermentation process for Koumiss inhibitory effect on Salmonella by response surface methodology

HAN Lei,YIN Wen-zheng*,YUE Zhi-hui

(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

In this experiment,fresh mare's milk as raw material,the fermentation temperature and time,lactic acid bacteria and yeast inoculation and vaccination proportion were investigated to develop the influence of three factors on Koumiss inhibitory effect by single factor test. The fermentation conditions of Koumiss inhibitory effect were further optimized by the response surface. The results showed that optimal conditions for Koumiss fermentation were as follows;fermentation temperature 33 ℃,fermentation time 89 h,inoculums 5.6%∶2.4%,the predicted zone of inhibition effect was 17.794 mm,and experimental verification was 17.70 mm,the deviation was 0.53%.The optimized of the inhibition effect of Koumiss by response surface analysis methods was accurate and reliable.

Koumiss;inhibitory effect;response surface analysis;fermentation condition

2015-02-23

韩磊(1990-)，男，硕士研究生，研究方向:食品科学,E-mail：hanlei1990714@163.com。

*通讯作者:殷文政(1959-)，男，硕士，教授，研究方向：微生物与食品安全,E-mail：yinwenzheng1959@126.com。

内蒙古自然科学基金项目(2014MS0359)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)23-0214-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.036