富含GABA的纳豆咀嚼片生产技术研究

田 璐,杨润强,沈 昌,顾振新

(南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

富含GABA的纳豆咀嚼片生产技术研究

田 璐,杨润强,沈 昌,顾振新*

(南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

本研究在大豆发芽富集γ-氨基丁酸(GABA)的基础上,接种纳豆芽孢杆菌,37 ℃下发酵24 h,经干燥、粉碎后,制作富含GABA和纳豆激酶(NK)的纳豆咀嚼片。结果表明:采用柠檬酸低氧发芽后再经低温冷冻与回温处理,发芽大豆中GABA含量高达1.24 mg/g DW;经纳豆芽孢杆菌发酵后大豆中GABA含量升至3.87 mg/g DW,同时NK活力升至每克鲜纳豆0.06个TAME单位;以45%的纳豆粉为原料制作的咀嚼片中GABA含量达到2.07 mg/片,纳豆激酶(NK)活力为0.063 TAME单位/片。通过该生产技术,可生产富含GABA和NK活力的功能性纳豆咀嚼片。

纳豆,纳豆激酶,γ-氨基丁酸,咀嚼片

近年来,随着人们生活方式的改变、人口老龄化、环境不断变化等,高血压、心脑血管疾病等成为危害人类健康的严重疾病之一[1]。血压水平与心血管病之间存在密切的关系,国外Framingham心脏研究发现,高血压会增加冠心病、心血管病的危险[2]。

γ-氨基丁酸(GABA)和纳豆激酶(Nattokinase,NK)对人体心血管疾病的预防作用已被越来越多的消费者所认识。GABA是哺乳动物中枢神经系统的抑制性神经递质,具有降低血压、改善脑机能、抗惊厥、预防和治疗癫痫、活化肾肝等作用[3]。随着年龄的增大,人体自身合成的GABA不足,需要从食物中摄取。正常条件下,植物体内GABA含量较低,在0.03～2.00 μmol/g FW之间[4],但受到逆境胁迫时GABA含量迅速增加[5],热激、缺氧、低温、盐胁迫等逆境均可使GABA在植物中积累[6-7]。纳豆是一种历史悠久的传统大豆发酵产品,含有蛋白酶、多种维生素、γ-谷氨酰基转肽酶、α-多聚谷氨酸等多种物质,具有降血压、抗肿瘤、抗氧化等功效[8]。NK是纳豆芽孢杆菌在纳豆中发酵而产生的,是纳豆最主要的功能性物质,NK能激活血液中的血纤溶酶原,从而溶解血栓,预防和治疗心脑血管疾病,具有高效安全、价格低廉、无任何副作用等特点。

富含GABA的产品开发[9]始于日本,目前已趋于成熟。1987年津志田藤二郎等[10]首次用低氧处理茶叶得到γ-氨基丁酸茶,片桐充昭和清水纯夫[11]用CO2处理大豆芽,早川洁等[12]用乳酸菌发酵饮料,大坪贞视[13]浸泡处理含米胚芽的米糠,这些方法都使得原料中富集了GABA。

表1 纳豆咀嚼片评分标准

纳豆起源于中国发展于日本,目前其生产也逐渐工业化,但是同时富含GABA和NK的产品未见报道,且在纳豆口味的改良上具有极大的研究意义。

本研究以富含GABA的大豆为原料[14],接种纳豆枯草杆菌(Bacillussubtilis),生产富含GABA的纳豆,并制作咀嚼片,旨在为开发富含GABA的纳豆制品提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆(品种:云鹤YH-NJ)产自东北吉林省;纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilis)本实验室保存。

GABA标准品(≥99%)、对二甲氨基苯磺酰氯(≥99%) 均购自Sigma公司;甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯(98%)、变色酸 购自阿拉丁公司;牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250 均购自索莱宝公司,三氯醋酸、高锰酸钾、硫酸、亚硫酸钠、大豆蛋白胨 均购自国药集团上海化学试剂公司。

表2 市售产品与咀嚼片中GABA含量

表3 市售产品与咀嚼片中NK活力

安捷伦液相色谱仪 Agilent 1200 美国安捷伦公司;UV-2802型紫外可见分光光度计 上海尤尼科仪器有限公司;Orion818型pH测试仪 Orion Research有限公司;PYX-9030A型隔水电热恒温发芽箱 上海跃进医疗器械厂;多功能活氧机BG-LJ30OA 北理国科臭氧应用技术有限公司;LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 富含GABA的纳豆制作流程 大豆→消毒→30 ℃浸泡6 h→低氧发芽18 h,通气量1.0 L/min→-20 ℃低温胁迫12 h→25 ℃回温6 h→去皮→121 ℃蒸煮15 min→冷却→接种纳豆芽孢杆菌→37 ℃发酵24 h→后熟[15]。

1.2.2 不同处理方式对大豆GABA富集的影响 方式一:30 ℃下清水浸泡6 h;方式二:以清水为培养液低氧发芽18 h,通气量1.0 L/min;方式三:采用10 mmol/L的柠檬酸缓冲液(pH5)低氧培养18 h,低氧通气量为1.0 L/min;方式四:-20 ℃下冷冻12 h,25 ℃下回温6 h。

1.2.3 咀嚼片制作流程 富含GABA的纳豆→冻干→打粉→配料(综合咀嚼片的功能效果和压片效果,添加45% 纳豆冻干粉),辅料(山梨糖醇、木糖醇、乳糖等)、粘合剂(60%乙醇)、香精(草莓、香橙、牛奶香精)→制软材→制粒→整粒→压片→成品(成品规格是1.5 g/片)。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 GABA含量 采用HPLC法[16]测定,样品经过前期处理得到用碳酸钠缓冲液溶解的提取液,用4-二甲氨基偶氮苯磺酰氯丙酮溶液对其衍生,样品直接用来测定色谱下的吸收峰。

1.3.2 NK活性测定 采用TAME法[17]测定,取成熟纳豆0.5 g,粉碎后加灭菌水5 mL,搅拌,静置过夜,在4000 r/min 离心30 min,收集上清液冷冻保存。取0.1 mL样品液,用变色酸法测定574 nm的吸光值。NK活力以TAME单位来表示,即每分钟每克纳豆中NK水解1 μmol TAME的量为一个活力单位。

样品量是指纳豆样品的质量(g DW);VT为磨样体积(mL);VS为测定时的取样量(mL),每次取样品浸提液0.1 mL反应;时间是指 NK与TAME底物反应的时间(min);甲醇的量单位为μmol。

1.3.3 感官评价 根据GB/T 15682-2008方法评定。选定10人进行感官评价的专业培训,并采用10人品尝法对纳豆咀嚼片制粒效果(ZL)、压片效果(YP)、风味(FW)和口感(KG)等方面进行感官评定,评分标准见表1,每项满分为10分,每一项得分的均值乘以权重得到综合评分。评定的咀嚼片有原味、奶香味、香橙味和草莓味四种。

总分=ZL×20%+YP×20%+FW×30%+KG×30%

式1

1.3.4 统计分析 实验设3次生物学重复,各指标测定设3次技术重复,结果以平均值±标准偏差表示。实验数据采用SAS9.0软件(SASInstituteInc.,NC,USA)进行方差分析,在0.05水平上进行显著检验(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同处理阶段对发芽大豆中GABA含量的影响

不同的上标字母表示在0.05的水平下有显著性差异,图2～图4、表2、表3同。

由图1可知,采用柠檬酸低氧发芽后低温保存并回温处理时,发芽大豆中GABA含量最高,为1.24 mg/g DW,而浸泡处理仅为0.21 mg/g DW。由此可见,柠檬酸低氧发芽后低温保存并回温的处理方式能使大豆中GABA含量提高约6倍。

2.2 纳豆生产不同阶段大豆中GABA含量变化

蒸煮对GABA含量的影响不显著,由此可知GABA具有较好的热稳定性,且对高温有一定的耐受能力。发酵后GABA的含量是3.87 mg/g DW,为发芽后的3.9倍,蒸煮后的6.4倍,冻干和打粉对纳豆中GABA的含量无显著影响。咀嚼片中含有45%的纳豆粉,纳豆咀嚼片中GABA的含量为1.38 mg/g,即咀嚼片中GABA含量为2.07 mg/片,本方法生产的咀嚼片中的GABA含量是市售纳豆及NK咀嚼片中GABA含量的4～8倍。

图1 不同处理阶段对发芽大豆中GABA含量的影响Fig.1 Influence of different treatment period on the GABA content in sprout soybean注:1-方式一;2-方式一和二;3-方式一和三;4-方式一、二和四;5-方式一、三和四。

图2 纳豆咀嚼片不同生产阶段GABA含量Fig.2 GABA content in different natto chewable tablet production stages

2.3 发酵及后熟对纳豆中可溶性蛋白含量和NK活力的影响

发酵后大豆中可溶性蛋白的含量显著降低,而NK的活力升至每克鲜纳豆0.06个TAME单位。由此可知,发酵过程中纳豆菌利用大豆中的蛋白质作为氮源,产生次级代谢产物-NK,在此过程中蛋白质被水解,形成更利于人体吸收的氨基酸,使纳豆的营养价值得到提高。结果亦显示,发酵显著降低纳豆中蛋白质含量,但是显著提高NK活力(图3),后熟使蛋白质含量有所下降,但NK活力无显著变化。

图3 发酵及后熟对纳豆中可溶性蛋白含量和NK活力的影响Fig.3 Influence of fermentation and postripeness on soluble protein content and NK activity in natto

2.4 纳豆咀嚼片不同生产阶段NK活力

图4 产品不同阶段NK活力Fig.4 The NK activity in different production stages of natto chewable tablet

纳豆发酵完成后保存在-20 ℃下,低温条件下NK比较稳定,即使经过冷冻干燥和高速粉碎,NK的活力仍无显著下降。但咀嚼片中NK活力有所降低,原因是在长期保存和制作过程中纳豆粉中的NK活性有所降低,导致生产出的咀嚼片NK活力相对减少,但该咀嚼片中NK活力仍有0.042 TAME单位/gDW,每片咀嚼片1.5 g,即每片咀嚼片中酶活为0.063 TAME单位,虽略低于上述市购纳豆激酶咀嚼片中NK活力,但仍具有较高的酶活性,具有较强的溶血栓能力。

2.5 不同风味的纳豆咀嚼片产品中GABA含量及NK活力

表4 产品感官评定值

注:英文字母a、b表示在0.05水平上有显著性差异。

四种不同口味的纳豆咀嚼片,在GABA含量以及NK活力上都没有显著性差异,表明GABA含量和NK活力都只与咀嚼片中纳豆粉的含量有关,而与辅料、调味剂、粘合剂、香精等添加剂的含量无关(图5)。

图5 不同口味的纳豆咀嚼片中的GABA含量及NK活力Fig.5 GABA content and the NK activity in different natto chewable tablets

2.6 不同风味的纳豆咀嚼片感官评定结果及分析

纳豆冻干粉的含量会直接影响咀嚼片的制粒效果,咀嚼片中冻干粉的含量过多会导致制片松散甚至不能成形。而从纳豆咀嚼片的功能来分析,其中含有纳豆冻干粉的原料越多效果就越好。综合两方面,纳豆咀嚼片中以添加45%的纳豆冻干粉为宜,其余添加辅料[18],包括山梨糖醇、乳糖、甘露醇、柠檬酸、蔗糖、粉末香精以及每种口味所特有的香味成分。

由实验结果可知,四种不同口味的纳豆制颗粒效果和压片效果均无显著差异,在口感和风味上,奶香味、香橙味、草莓味无显著差异,但显著优于原味。说明添加奶粉、香橙、草莓添加剂均能有效改善纳豆的口味,掩盖纳豆不易被人接受的特殊气味。

3 讨论

NK的酶学性质比较稳定,反复融冻对其活力影响较小,且NK在40 ℃下保温30 min活力无变化[19],这就保证了纳豆咀嚼片在制片过程中冻干以及在35～45 ℃烘干不会使NK失活。据报道[20],当NK与煮沸过的小麦或大米提取液混合后,NK的稳定性显著增加,明胶、海藻酸钠、糊精、甘露醇等在高温环境下能起到稳定NK的作用[21-22]。本研究中NK附着在蒸煮过的大豆上,添加了糊精和甘露醇作为辅料,确保了NK的活性。

与发芽富集GABA的大豆相比,纳豆中GABA的含量显著升高,表明GABA在大豆发酵过程中得到进一步富集,该结果与渠岩等[23]的报道一致。GABA是由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶(GAD)催化转化而来的[24],微生物发酵过程中GAD大量表达,以合成GABA[25]。

蒋立文等[26]测定了几种不同发酵制品中GABA的含量,其中阳豆豉中的含量为3.45 mg/g(干基),腊八豆为0.2 mg/g(干基),永川豆豉为0.15 mg/g(干基),都显著少于本技术生产的纳豆中GABA的含量。日本政府已明确规定天然原料发酵产制的GABA产品可作为营养辅助食品,规定GABA的摄入量通常为每日20～30 mg,分2次食用,最高日摄食量应低于100 mg,是极安全的物质[27]。本研究中市购的NK咀嚼片经过行业认证的NK活力为1750 FU,推荐每日服用量为3000～7000 FU,用本研究中的方法测定该市购NK咀嚼片的NK活力,用TAME单位表示,其活力为0.077 TAME单位。而本研究生产的纳豆咀嚼片中NK酶活为0.063TAME单位。因此,每日服用本纳豆咀嚼片5片即可达到效果。

4 结论

以富集GABA的大豆为原料,生产纳豆并制作咀嚼片完全可行。以45%纳豆粉为原料,添加矫味剂、辅料和粘合剂,生产的纳豆咀嚼片中GABA含量为2.07 mg/片,纳豆激酶(NK)活力为0.063 TAME单位/片,具有很高的营养价值和保健功能。

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Research of production technology of GABA-riched Natto chewable tablet

TIAN Lu,YANG Run-qiang,SHEN Chang,GU Zhen-xin*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Bacillusnattowas vaccinated to soybean which was rich inγ-aminobutyric acid(GABA)after germination and germinated soybean was fermented at 37 ℃ for 24 h. Natto chewable tablets rich in GABA and nattokinase(NK)activity was produced after being dried and crushed. Results showed that GABA content in germinated soybean reached 1.24 mg/g DW after being soaked in citric acid,along with hypoxia,freezing and thawing treatments. The content of GABA was up to 3.87 mg/g DW and NK activity was up to 0.06 TAME units in per gram fresh natto after being fermented byBacillusnatto. Each pill of natto chewable tablet had 2.07 mg GABA and 0.063 TAME units NK when 45% of natto powder was added. Based on this conditions above in this paper,the Natto chewable tablet which was rich inγ-aminobutyric acid(GABA)and also had high nattokinase(NK)activity could be prepared.

Natto;Nattokinase;γ-aminobutyric acid;chewable tablets

2015-01-28

田璐(1992-)，女，硕士研究生，研究方向为食品功能性物质的富集，E-mail：2014108022@njau.edu.cn。

*通讯作者:顾振新(1956-)，男，博士，教授，研究方向：生物技术与功能食品，E-mail：guzx@njau.edu.cn。

国家自然科学基金青年项目(31071581)；江苏高校优势学科建设工程资助项目( PAPD)。

TS218

A

1002-0306(2015)23-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.025