槲皮素、EGCG对胆固醇酯酶活性和胆固醇胶束抑制作用研究

苏建辉,马朝阳,杨 鹿,王洪新,2,*,高传忠,聂荣京

(1.江南大学食品学院,江苏无锡 214122;2.江南大学国家功能食品工程技术研究中心,江苏无锡 214122;3.铜陵瑞璞牡丹产业发展有限公司,安徽铜陵 244000)

槲皮素、EGCG对胆固醇酯酶活性和胆固醇胶束抑制作用研究

苏建辉1,马朝阳1,杨 鹿1,王洪新1,2,*,高传忠3,聂荣京3

(1.江南大学食品学院,江苏无锡 214122;2.江南大学国家功能食品工程技术研究中心,江苏无锡 214122;3.铜陵瑞璞牡丹产业发展有限公司,安徽铜陵 244000)

为降低胆固醇酯类水解及小肠对胆固醇的吸收,本实验体外模拟人体小肠内环境,研究EGCG和槲皮素对胆固醇酯酶活性及胆固醇胶束溶解度的抑制效果。同时比较了9种功能因子对胆固醇酯酶活性及胆固醇胶束溶解度的抑制效果。结果表明,槲皮素和EGCG均降低了胆固醇胶束溶解度,IC50值分别是2.2、0.08mg/mL,其抑制效果呈浓度依赖性;槲皮素和EGCG对胆固醇酯酶活性的IC50值分别是0.27、1.43mg/mL。槲皮素对胆固醇胶束溶解度的抑制效果小于EGCG,但是对胆固醇酯酶活性的抑制效果大于EGCG。结果初步证明了,槲皮素和EGCG延迟了餐后高胆固醇形成,对高血脂症有一定的预防和治疗作用。

槲皮素,EGCG,胆固醇胶束,胆固醇酯酶,降脂

近年来,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)成为威胁人类健康的严重疾病之一。CVD的主要危险因素有高血压、高血脂、糖尿病等,其中高血脂症多发于中老年人群。高血脂对身体的损害是隐匿的、逐渐进行性和全身性的。研究认为降血脂机制通过抑制胰脂肪酶的活性降低了对外源性甘油三酯的吸收,降低脂肪酸合成酶的活性而减少了脂肪的合成,加速胆固醇代谢促进胆固醇排泄来调节胆固醇代谢[1-2]。胆固醇酯酶是催化胆固醇酯水解成胆固醇和脂肪酸的一种酶。来自胆固醇酯的胆固醇的生物利用度是由胆固醇酯酶控制的,这与基因敲除研究的结果相符[3]。膳食中的胆固醇在人体肠道中,溶于胆固醇胶束才能被人体吸收。抑制饮食中的胆固醇吸收是降低血液中胆固醇的有效方法[4]。近几年,国内外大量报道证实茶多酚具有降血脂作用[5-7],儿茶素占茶叶中茶多酚总量的60%～80%,表没食子儿茶素没食子酸(EGCG)含量最高。槲皮素是一种天然黄酮类化合物,多以苷的形式存在于植物的花、叶、果实中,研究证实槲皮素具有扩张血管、降血压、降血脂、降低毛细血管通透性和脆性、防治冠心病等药理活性[8-10]。本实验比较分析了EGCG和槲皮素对胆固醇酯酶活性和胆固醇胶束溶解度的影响,为EGCG和槲皮素降血脂研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

表没食子儿茶素没食子酸(EGCG)、槲皮素,绞股蓝皂甙、苦瓜素、丹皮酚、魔芋多糖、葛根素纯度为98%,枸杞多糖、玉竹多糖,纯度为80%以上 以上均购于南京景竹生物科技公司;牛磺胆酸钠(STC),胆固醇,猪胰腺胆固醇酯酶(pCE)和底物对硝基苯基丁酸酯(PNPB) Sigma公司;胆固醇检测试剂盒 南京建成;其他试剂 国产分析纯。

UV-2100 UNIC紫外可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司;BS-1E恒温振荡培养箱 金坛市瑞华仪器有限公司;TGL-16C离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 胆固醇酯酶的抑制活性测试 参照文献[11],略修改,测试温度保持在(25.0±0.2)℃。所有的反应在含有NaCl(0.1mol/L)、对硝基苯基丁酸酯PNPB(0.2mmol/L)、牛磺胆酸钠STC(5.16mmol/L)的磷酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH7.04)中进行。pCE预先溶解在高纯水中;底物PNPB和抑制剂预先溶解在乙腈中,在-20℃保存。加入猪胰腺胆固醇酯酶启动反应,25.0℃反应5min,在405nm紫外可见分光光度计检测。

表1 胆固醇酯酶活性测定反应体系Table 1 Reaction system of cholesterol esterase activity

注:-加入等体积蒸馏水。

酶抑制活性的计算公式如下

抑制率(%)=100×[A-B-(C-D)]/(A-B)

式(1)

式中:A:空白管在405nm的吸光度值;B:空白对照管在405nm的吸光度值;C:抑制剂管在405nm的吸光度值;D:背景对照管在405nm的吸光度值。

1.2.2 胆固醇胶束溶解度的测定 其中1mL胶束溶液中含有10mmol/L牛磺胆酸钠,2mmol/L胆固醇,5mmol/L油酸,132mmol/L NaCl,15mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)。100W,40min超声波均质进行制备。37℃隔夜静置。将空白对照,一定量的EGCG、槲皮素和壳聚糖样品分别加入到胶束溶液中,然后将混合溶液在37℃振荡培2h,并在16000r/min离心20min,收集上清液用试剂盒测定胶束中胆固醇含量[12]。

抑制率(%)=(空白溶液的胆固醇溶解度-样品溶液的胆固醇溶解度)/空白溶液的胆固醇溶解度

1.3 数据处理

所有测定指标的数据平行测定3次后取平均值,应用Excel和SPSSl7.0软件进行数据处理,应用Origin8.6软件进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 九种功能因子对胆固醇酯酶活性的抑制效果

图1比较了浓度为0.5mg/mL的九种功能因子对胆固醇酯酶活性的抑制效果。由图可以看出,槲皮素对胆固醇酯酶活性抑制作用最强为92%,EGCG对酯酶的活性较弱为27%,已有动物实验研究表明绞股蓝皂甙有较好的降血脂效果[13],Yang Yuehui研究发现绞股蓝皂甙可以降低高脂大鼠血清内谷胱甘肽过氧化物酶及超氧化物歧化酶活性,同时还发现肝脏内甘油三酯及胆固醇含量降低[14],本研究发现其对胆固醇酯酶活性有较强的抑制作用,也许对胆固醇酯酶活性的作用效果也是其降脂机制的一方面。由图1还可以看出牡丹籽油对胆固醇酯酶也有较好的抑制活性,牡丹籽油富含亚麻酸、亚油酸等多不饱和脂肪酸[15]。科学家对于富含多不饱和脂肪酸的鱼油降脂效果研究较多[16],Takuya Mori研究发现鱼油影响了脂类代谢相关酶的活性,小鼠体内的脂肪酸氧化及苹果酸脱氢酶的活性也发生了变化。然而对于牡丹籽油的降血脂效果目前还没人研究,实验发现富含多不饱和脂肪酸的牡丹籽油降低了胆固醇酯酶活性,也许这也是多不饱和脂肪酸的降脂途径。

图1 九种功能因子对胆固醇酯酶活性抑制率Fig.1 Effect of nine functional factors on the inhibition of pancreatic cholesterol esterase activities

2.2 九种功能因子对胆固醇胶束溶解度的抑制效果

体外模拟人体小肠内的环境,图2比较了浓度为1mg/mL的九种功能因子对胆固醇胶束溶解度的抑制效果。由图中可以看出EGCG降低了胆固醇在胶束溶液中的溶解度,其作用效果在九种功能因子中最好。国内外已有文献资料表明苦瓜素和槲皮素对高血脂动物的降脂效果[17-18]。本研究从另一方面阐述了苦瓜素和槲皮素的降脂机制,其胆固醇的结合力稍弱于EGCG,但是也可以降低小肠内胆固醇胶束溶解度,抑制小肠对胆固醇的吸收,实现降脂目的。由图2可以看出牡丹籽油降低了胆固醇胶束的溶解度,植物油含有丰富的甾醇类物质[19],FRED H研究发现植物甾醇可以降低胆固醇胶束的溶解度,从而减少小肠对胆固醇的吸收。由此可以推测也许是牡丹籽油中的甾醇类物质降低了胆固醇胶束的溶解度[20]。

图2 九种功能因子对胆固醇胶束溶解度抑制率Fig.2 Effect of nine functional factors on the inhibition of cholesterol micelle

2.3 EGCG和槲皮素对胆固醇酯酶活性抑制效果研究

由图3可以看出,槲皮素和EGCG对胆固醇酯酶的抑制效果表现出剂量依赖性,随着浓度的增加,其抑制效果越来越强。槲皮素浓度在小于0.4mg/mL时,其对胆固醇酯酶的抑制效果随浓度增加,增长很快,0.4mg/mL以后抑制效果对浓度的依赖性减弱,在0.5mg/mL时,抑制率达到92.3%,其IC50为0.27mg/mL。Piotr研究槲皮素对高胆固醇血细胞的影响,发现其有很高的抗氧化性同时降低了高胆固醇血细胞细胞膜的胆固醇含量[13]。本研究发现槲皮素可以很强的抑制胆固醇酯酶活性。相比于槲皮素,EGCG对胆固醇酯酶活性的抑制效果明显较弱,其对酶活性的抑制效果也是呈现剂量关系,在1.5mg/mL后逐渐出现平台期,在2.0mg/mL时其抑制率为59.6%,IC50为1.43mg/mL。现有研究较多的是EGCG和槲皮素黄酮类物质对胰脂肪酶活性的研究,EGCG对胰脂肪酶有较强的抑制活性,抑制了小肠对脂肪的吸收[21]。Chan等研究发现茉莉花茶儿茶素可以剂量依赖性地降低仓鼠血清TC水平,且排泄物中中性固醇和酸性固醇的浓度很高,但胆固醇合成的限速酶3-羟-3-甲戊二酸单酰辅酶A还原酶和乙酰辅酶A胆固醇酰基转移酶的活性未改变[22]。目前对胆固醇酯酶活性的研究较少,Li研究了膦香豆素对胆固醇酯酶活性的抑制效果[11],比较了不同单体的IC50。目前还没有EGCG和槲皮素黄酮类对胆固醇酯酶活性的研究的报道,其不同的作用效果也许是因为不同位点羟基官能团。具体机制还有待研究。

图3 EGCG和槲皮素对胆固醇酯酶活性的抑制效果Fig.3 Effect of EGCG and quercetin on the inhibition of pancreatic cholesterol esterase activities

2.4 EGCG和槲皮素对胆固醇胶束溶解度的抑制效果分析

对于壳聚糖的降血脂机制目前研究较多的是其与胆固醇、胆酸盐的物理性吸附[23-25],本实验体外模拟人体小肠条件,以壳聚糖为对照,比较了EGCG、槲皮素与胆固醇结合能力。由图4可以看出,三者与胆固醇的结合力呈现剂量依赖性,随着样品浓度增加,胆固醇在胶束中的溶解度逐渐降低。三者都可以降低胆固醇在胶束溶液中的溶解度,比较三者与胆固醇的结合力发现,EGCG与胆固醇结合力最强,0～0.1mg/mL时作用效果最强,0.1mg/mL后抑制速率减慢,1mg/mL时达到100%。其IC50为0.08mg/mL。由图中可以看出槲皮素与胆固醇的结合力弱于EGCG,2mg/mL时对胆固醇胶束的溶解度抑制率是56.9%,以后抑制速率逐渐减慢,4mg/mL时为73.5%,IC50为2.2mg/mL。本实验研究发现低浓度壳聚糖与胆固醇的结合力小于EGCG和槲皮素,其IC50大于5.0mg/mL,壳聚糖与胆固醇结合力的大小,也许是和壳聚糖的脱乙酰程度或者是壳聚糖的粒径有关[25]。Marioa研究发现茶黄素降低了胆固醇在胶束溶液中的溶解度,通过粒径大小分析和透射电镜观察发现胶束溶液中加入茶黄素后,形成了大颗粒[26]。EGCG和槲皮素也许是和胆固醇结合形成了大颗粒不能溶于胶束溶液,降低了其在胶束溶液中的溶解度,具体机制还有待研究。

图4 EGCG和槲皮素对胆固醇胶束溶解度的抑制效果Fig.4 Effect of EGCG and quercetin on the inhibition of cholesterol micelle

3 结论

比较了9种功能因子对胆固醇酯酶和胆固醇胶束溶解度的影响,研究发现槲皮素、皂甙和牡丹籽油对胆固醇酯酶活性有较好的抑制效果。EGCG和苦瓜素可以很明显的降低胆固醇在胶束中的溶解度。然而,多糖类物质对胆固醇酯酶和胆固醇胶束溶解度的作用效果较弱。槲皮素和EGCG一方面抑制胆固醇酯分解为游离的胆固醇,另一方面降低胆固醇在胶束溶液中的溶解度,抑制了小肠对胆固醇的吸收,起到了降脂的目的。

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Inhibition of pancreatic cholesterol esterase activities and cholesterol micelle of EGCG and quercetin

SU Jian-hui1,MA Chao-yang1,YANG Lu1,WANG Hong-xin1,2,*,GAO Chuan-zhong3,NIE Rong-jing3

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122，China;2.National Engineering Research Center for Functional Food,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3.Anhui Tongling Ruipu Peony Industry Development Co.,Ltd.,Tongling 244000,China)

The aim of the present study is to investigate the effect of EGCG and quercetin on the inhibition of pancreatic cholesterol esterase activities and cholesterol micelle formation which may result in a reduced cholesterol absorption and hydrolysis of dietary cholesterol esters. The inhibition of nine functional factors on pancreatic cholesterol esterase activities and cholesterol micelle formation were compared. The results showed that both of EGCG and quercetin had obvious effect on inhibiting cholesterol micelle formation and the 50% inhibiting concentration(IC50,mg/mL)of each was 0.08,2.2mg/mL,which was lower than chitosan. The IC50of EGCG and quercetin on pancreatic cholesterol esterase was 1.2,0.28mg/mL. The inhibition of cholesterol micellization by quercetin was weaker than EGCG,but quercetin showed stronger pancreatic cholesterol esterase inhibitory activity. It was suggested that EGCG and quercetin may delay postprandial hypercholesterolaemia,and therefore may be applied for the prevention and treatment of hyperlipidaemia.

quercetin;EGCG;cholesterol micelle;pancreatic cholesterol esterase;hypolipidemic

2014-07-24

苏建辉(1981-),女,博士研究生,研究方向:食品营养与功能因子。

*通讯作者:王洪新(1981-),男,博士,教授,研究方向:食品营养与功能因子。

国家125项目(2012BAD33B05)；功能食品设计及制造关键技术与产品;安徽铜陵瑞璞牡丹产业发展有限公司合作项目。

TS201.4

A

1002-0306(2015)11-0346-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.062