双酶酶解葵花籽粕蛋白制备抗氧化多肽的研究

2015-05-05罗丰收孔令明

食品工业科技 2015年11期

关键词：葵花籽多肽清除率

董聪,李芳,王琳,罗丰收,冷娟,孔令明,*

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052;2.新疆轻工职业技术学院,新疆乌鲁木齐 830021)

双酶酶解葵花籽粕蛋白制备抗氧化多肽的研究

董聪1,李芳2,王琳1,罗丰收1,冷娟1,孔令明1,*

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052;2.新疆轻工职业技术学院,新疆乌鲁木齐 830021)

葵花籽粕蛋白,酶解,多肽,抗氧化活性

向日葵,属菊科向日葵属,属一年生草本植物,又名太阳花,对环境适应性强、抗旱、抗涝、抗碱[1],新疆地处欧亚大陆中部,光照资源丰富,干旱少雨,昼夜温差大,较适合向日葵生长,目前全疆每年向日葵的种植面积在10万亩左右,年产葵花籽25.39万吨[2]。

葵花籽粕是葵花籽制油时的副产物,葵花籽粕营养物质丰富,富含29%～43%的优质的植物蛋白[3],且氨基酸组成均衡,蛋白组成为:55%的球蛋白、1%～4%的醇溶蛋白、11%～17%的谷蛋白和20%的清蛋白[4]。据报导,葵花籽粕中还含有大量的钙、磷和烟酸[5],大量的类脂、碳水化合物、还原糖、灰分[6]及天然食用红色素、糠醛等[7]。

葵花籽粕蛋白质具有很好的蛋白特性,且可制备多肽抗氧化剂和ACE抑制剂[8],同时也是一种良好的肉类制品添加剂,但目前,葵花籽加工仅限于榨油和制作炒货食品,其榨油后的粕含有丰富的蛋白质但利用率不高,多用作牲畜饲料或者直接抛弃,其经济价值并未被充分利用,这不仅造成了极大的资源浪费而且还污染环境,对于其的精深加工值得人们重视。

表2 蛋白酶活力Table 2 Protease activity

为拓宽葵花籽粕综合利用前景,对复合酶解葵花籽粕蛋白制备抗氧化活性多肽工艺进行优化,从而提高葵花籽粕利用率。研究成果将为葵花籽综合利用及开发功能性食品提供科学数据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葵花籽粕新疆庄子实业有限公司提供;碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味酶及木瓜蛋白酶南宁庞博生物工程有限公司;胰蛋白酶及胃蛋白酶美国BIOSHARP公司;复合蛋白酶上海源叶生物科技有限公司;无水乙醇、正己烷、氢氧化钠、浓硫酸、邻菲罗啉、硫酸亚铁、邻苯三酚等均为分析纯。

SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵巩义市英峪予华仪器厂;旋转蒸发器仪上海青浦泸西仪器厂;电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器有限公司;雷磁PHS-3C 上海仪电科学仪器股份有限公司;AL204-1C型电子天平上海梅特勒托利多仪器有限公司;TD5A-WS台式低速离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司;TU-1810紫外分光光度计北京普析通用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葵花籽粕蛋白提取工艺葵花籽粕→粉碎→脱脂→脱绿原酸→浸提(粕∶水=1∶25、pH10、超声波温度为50℃、超声波功率700W、超声时间90min)→离心(4500r/min、10min)→取上清→脱色(4%H2O2浸泡30min)→调pH为等电点→离心(4500r/min、15min)→取下层→真空冷冻干燥→粉碎(80目)→葵花籽粕蛋白粉[9]。

1.2.2 葵花籽粕蛋白中理化成分的测定蛋白质含量,凯氏定氮法(GB/T5009.5-2010);粗脂肪含量:索氏抽提法(GB/T14772-2008)。

1.2.3 蛋白酶活力的测定参照文献[10]方法(福林-酚法)。

1.2.4 水解度的测定参照文献[11]方法(pH-stat法)。水解度(DH)的计算公式为:

式中:V为消耗碱液体积(mL);c为碱液浓度(mol/L);ɑ为ɑ-氨基的解离度;m为底物中蛋白质含量;htot为底物蛋白质中的肽键总数,对葵花籽粕蛋白而言,htot=7.5mmol/g。

1.2.5 抗氧化能力的测定

1.2.5.1 多肽羟基自由基(·OH)清除能力的测定参照文献[12]方法(邻二氮菲-Fe2+氧化法)。

1.2.7 葵花籽粕蛋白制备葵花籽粕多肽的酶解工艺葵花籽粕蛋白→粉碎(过80目筛)→悬浮液(2%(w/v))→热变性处理(100℃,10min)→调pH至最适→水浴酶解→灭酶(100℃,15min)→离心(4500r/min,15min)→取上清液[13]即为葵花籽粕多肽酶解液。

1.2.8 单因素实验选用最适蛋白酶,确定在酶解过程中复合酶比例、pH、温度、酶解时间、[E]/[S]、底物浓度对葵花籽粕多肽抗氧化能力的影响。

1.2.9 响应面法优化酶解条件实验在单因素的基础上,以抗氧化能力为响应值,选择酶解时间(X1)、pH(X2)及复合酶比例(X3)进行三因素三水平响应面实验,通过响应曲面分析对酶解条件进行优化,见表1。

表1 实验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

2 结果与分析

2.1 葵花籽粕蛋白的蛋白质含量

根据GB/T 5009.5-2010测得葵花籽粕蛋白中蛋白质含量为74.20%。

2.2 葵花籽粕蛋白的粗脂肪含量

根据GB/T 14772-2008测得葵花籽粕蛋白中粗脂肪含量为8.76%。

2.3 蛋白酶活力的测定

蛋白酶活力的测定结果如表2所示。

根据酶活力大小及10000U/g的添加比例可计算出蛋白酶筛选中每种酶的添加质量。

2.4 蛋白酶的筛选

选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、风味酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶分别在各自最适酶解条件对葵花籽粕蛋白进行酶解,以羟自由基清除率、超氧阴离子清除率及水解度为指标,确定其抗氧化能力如表3所示。

表3 不同蛋白酶的抗氧化能力Table 3 Antioxidant capacity of the different protease

2. 5 单因素实验结果

图1 复合酶比例对抗氧化能力的影响Fig.1 Effect of different Composite enzyme ratio on the antioxidation of protein hydrolysates

图2 [E]/[S]对抗氧化能力的影响Fig.2 Effect of different enzyme to substrate ratio on the antioxidation of protein hydrolysates

图3 pH对抗氧化能力的影响Fig.3 Effect of different pH on the antioxidation of protein hydrolysates

图4 底物浓度对抗氧化能力的影响Fig.4 Effect of different water to substrate ratio on the antioxidation of protein hydrolysates

表5 模型方差分析及模型系数显著性检验·)Table 5 Model significant inspection and regression model analysis of ·)

图5 温度对抗氧化能力的影响Fig.5 Effect of different temperature on the antioxidation of protein hydrolysates

图6 时间对抗氧化能力的影响Fig.6 Effect of different time on the antioxidation of protein hydrolysates

2.6 响应面实验设计模型及结果分析

对葵花籽粕多肽的·OH清除率响应面模型进行方差分析,模型系数显著性检验及资料结果见表6。

Y1(%)=66.64-0.11X1+2.04X2+7.24X3-2.82X1X2-0.048X1X+2.66X2X3-5.73X12-7.48X22-6.07X32

Y2(%)=49.86+3.60X1+2.500E-003X2+1.05X3-0.21X1X2+1.35X1X-1.44X2X3-3.70X12-3.48X22-4.61 X32

表6 模型方差分析及模型系数显著性检验(·OH)Table 6 Model significant inspection and regression model analysis of variance(·OH)

表4 根据Design-erpert8.0设计响应面实验方案及结果Table 4 The test scheme and results according to Design-erpery8.0 design response surface

由表6回归方差分析可知,模型的R2=0.9994说明回归方程有意义,F模型=4708.30(p<0.0001),模型极显著,失拟项F=0.33(p>0.05)结果不显著,表6说明该模型与实际实验拟合较好,可用于葵花籽粕蛋白质酶解工艺实验的预测。表6可知,时间和pH对·OH清除率影响极显著,但在复合酶比例为碱性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶3～3∶1范围内,复合酶比例对·OH清除率的影响作用不显著;X1X2和X2X3差异极显著说明时间与pH、pH与复合酶比例之间存在较强交互作用,X1X3差异高度显著说明时间和复合酶比例之间存在交互作用;X12、X22、X32均较显著说明各因素之间的关系是较为复杂的二次关系。图7～图11直观地反映了个因素之间的交互作用及其对抗氧化性的影响。

图7 时间和pH对·清除率影响的响应面图Fig.7 Response surface of time and pH on the scavenging capacity of ·

图8 pH和复合酶比例对·清除率影响的响应面图Fig.8 Response surface of pH and enzyme ratio on the scavenging capacity of ·

由图9可知,复合酶添加比例一定时,随着时间的延长和pH的增大,·OH清除率呈先升高后降低的趋势。如图所示,当酶解时间一定时,pH达7.5前,·OH清除率随pH的增大而增大;而pH达7.5后,继续增大pH,·OH清除率反而降低;随着酶解时间的延长,·OH清除率缓慢升高,酶解时间曲线变化较陡,酶解时间和pH比例之间的交互作用较为明显。

图9 时间和pH对·OH清除率影响的响应面图Fig.9 Response surface of time and pH on the scavenging capacity of ·OH

由图10可知,pH一定时,随着时间的延长和复合酶比例的增大,·OH清除率呈先升高后降低的趋势;当复合酶比例为2∶1时,·OH清除率达最大值;·OH清除率随时间的延长而缓慢增大,在3.4h左右达最大值,·OH清除率不再随时间的延长而增大。等高线呈椭圆表明酶解时间和复合酶比例之间的交互作用显著。

图10 时间和复合酶比例对·OH清除率影响的响应面图Fig.10 Response surface of time and enzyme ratio on the scavenging capacity of ·OH

由图11可知,酶解时间一定时,随着复合酶比例和pH的增大,·OH清除率呈先升高后趋势;但当·OH清除率增大到极值后,并未随复合酶比例和pH的增大而继续升高,反之有降低的趋势。等高线呈椭圆形说明时间和pH的交互作用显著,与方差分析结果一致。

图11 pH和复合酶比例对·OH清除率影响的响应面图Fig.11 Response surface of pH and enzyme ratio on the scavenging capacity of ·OH

3 结论

本文采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对葵花籽粕蛋白质进行复合酶解,得到抗氧化活性多肽。比较葵花籽粕多肽对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除率,确定其抗氧化作用。在单因素实验的基础上,通过响应曲面法获得最优酶解工艺为:酶解时间200min、pH7.6、复合酶比例2.5∶1、底物浓度2%、[E]/[S]2%、酶解温度50℃,在此条件下,葵花籽粕多肽液对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率分别为68.06%和50.12%,且水解度为24.39%。

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Preparation enzymatic sunflower meal protein for the antioxidant activity polypeptide by Bienzyme

DONG Cong1,LI Fang2,WANG Lin1,LUO Feng-shou1,LENG Juan1,KONG Ling-ming1，*

(1.College of Food and pharmaceutics,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China;2.Xinjiang Institute of Light Industry Technology,Urumqi 830021,China)