塞来昔布对细粒棘球蚴原头节生长及 p-ERK2 表达的影响

王 勃，姜玉峰，李芳芳，王 卓，邢国强，雷 颖，史红娟 ，张示杰，彭心宇，吕海龙

塞来昔布对细粒棘球蚴原头节生长及 p-ERK2 表达的影响

王 勃1，姜玉峰2，李芳芳1，王 卓1，邢国强1，雷 颖2，史红娟2，张示杰1，彭心宇1，吕海龙1

目的 探索塞来昔布对细粒棘球蚴原头节体外生长及p-ERK2表达的影响。方法 实验分组为1640培养基组、DMSO组、塞来昔布溶液(50、100、150、200 μmol/L)中体外孵育，在倒置焦镜下观察原头节的形态变化，同时通过0.1%伊红染色显示原头节活力。运用Western blot检测DMSO、100、150、200 μmol/L塞来昔布处理细粒棘球蚴原头节48 h后p-ERK2蛋白的表达量。结果 体外孵育7 d后，DMSO组及空白1640对照组原头节的活力几乎没有改变。塞来昔布作用1 d后，100、150、200 μmol/L组原头节的活力均下降；作用3 d后，200 μmol/L组原头节全部被杀死，150 μmol/L组的原头节活力为43.9%。100 μmol/L、50 μmol/L组对原头节的活力也有明显下降，但不及高浓度组显著。Western blot结果显示P-ERK2的表达量随浓度增加而下降趋势明显。结论 塞来昔布能够抑制细粒棘球蚴原头节生长，这可能与塞来昔布下调P-ERK2的表达进而抑制ERK2信号传导通路有关。

塞来昔布；细粒棘球蚴；原头节；ERK2通路

细粒棘球蚴病是一种危害严重的人兽共患病，在我国主要分布在畜牧地区[1]。目前对包虫病的治疗,手术仍然是主要的手段[2]，但术中易造成包虫囊肿囊液外溢，以及未杀死的原头节残留于手术创面或腹腔，这是导致手术后复发最主要的原因[3-4]，如果能寻找一种能在短时间内杀死头节又对周围正常组织损伤小的药物用于术后局部使用，有可能对预防复发起到有效的作用。

本研究以自然感染的绵羊肝细粒棘球蚴原头节为研究对象，观察塞来昔布对绵羊细粒棘球蚴原头节生长的影响，进一步评价塞来昔布用于临床抗包虫治疗的可能性，为塞来昔布在肝包虫病治疗的临床应用提供依据。

1 材 料

自然感染细粒棘球蚴病的绵羊肝脏，由新疆石河子市西部牧业有限公司提供，塞来昔布(西乐葆)购自美国辉瑞制药有限公司，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司，RPMI 1640培养基购自上海哈灵生物科技有限公司，小牛血清购自杭州四季青生物有限公司，山羊抗小鼠p-ERK2抗体购自Santa Cruze公司，小鼠抗β-actin单克隆抗体购自Santa Cruze公司。塞来昔布胶囊内容物用DMSO充分溶解，0.22 μmol/L滤器过滤备用(DMSO最终浓度<0.1%)。

2 方 法

2.1 细粒棘球蚴原头节的分离及体外培养 将新鲜的自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏带回实验室，生理盐水冲洗肝脏表面，洗干净后移入无菌超净台内用75%酒精消毒表面，用无菌方式抽取囊内容物置培养瓶中，静置数分钟使育嚢和原头蚴沉淀后弃去上清液，用PBS液反复冲洗去掉死亡的原头蚴，保证原头节活力大于98%(0.1%伊红染色)，然后体外培养原头节3 d，待适应体外环境后药物作用。

2.2 实验分组 本实验共计6组：培养基对照组、DMSO组及50、100、150、200 μmol/L的塞来昔布作用组。将体外培养的细粒棘球蚴原头节再次用PBS洗涤数次，使原头节活力接近100%，用RPMI 1640培养基混匀原头节。每组培养液中加入约2 000个原头节，置37 ℃、10%O2、5%CO2条件下培养，每隔24 h取作用后的头节80～100个，测活力并计数。隔3 d换培养液及复加药1次，连续观察7 d。实验独立重复3次。

2.3 Western blot检测蛋白定量表达 取100、150、200 μmol/L 塞来昔布作用48 h组，DMSO组的细粒棘球蚴原头节为对照，用pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤3遍，弃掉上清液，在电子天平中各组称取质量为10 mg的细粒棘球蚴原头节，加入150 μL RIPA裂解液，用超声粉碎仪迅速使原头节粉碎，置于冰上裂解15 min。然后移入高压过且在冰上预冷的1.5mL EP管中，置4 ℃离心机中离心，12 000 g，25 min，离心毕，小心抽取各管中的上清液置新的EP管中。提取总蛋白,测定蛋白含量并配平为统一浓度, 每个泳道蛋白的溶液体积5 μL,上样于SDS-PAGE凝胶进行电泳分离后,转移至PVDF膜, 5%BSA(内参用5%牛奶)均用TBST配制, 在常温下封闭2 h。 一抗(β-actin，P-ERK2)效价均为1∶1 000，4 ℃孵育18 h, TBST洗膜6次×5 min,随后加辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗小鼠效价为1∶25 000)室温下脱色摇床上摇动孵育2 h，漂洗同上。 暗室内加入化学发光剂显影，用胶片曝光并采图, 用凝胶图像处理系统分析目的条带。

2.4 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析、LSD检验及χ2检验，均以P<0.05为有统计学意义。

3 结 果

3.1 光镜下观察塞来昔布作用后的细粒棘球蚴原头节形态变化 倒置显微镜下观察，塞来昔布作用24 h后，各实验组均可见虫体不同程度的回缩，随药物浓度的增加外翻的原头节比例明显增加，体积变小。作用3 d后，各药物作用组原头节虫体边缘出现不同程度的损伤，边缘不规整，顶突外翻、小勾排列不齐、部分断裂脱落，虫体内钙颗粒数量减少、体积减小，顶突下方吸盘清晰可见，形态不规则。可见大部分头节因结构破坏被染成红色。空白对照组原头节顶突内陷,伊红染色拒染,可见原头节活动。

3.2 塞来昔布对细粒棘球蚴原头节生长的影响 不同浓度塞来昔布作用后的细粒棘球原头节活力曲线见图2。经χ2检验，各浓度塞来昔布作用组的原头节活力值与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。DMSO组7 d后活力为(95.5±0.5)%，培养基对照组作用7 d后活力为(96.5±0.3)%，差异无统计学意义(P>0.05)。200 μmol/L 塞来昔布作用原头节24 h后，活力仅为(3.1%±0.7%)。

Av Control protoscoleces B: Protoscoleces were incubated with DMSO; C: Altered protoscoleces after 1days p. i. with 100 μmol /L celecoxib;D: Altered protoscoleces after 3 days p. i. with 100 μmol /L celecoxib; E: Altered protoscoleces after 1days p. i. with 150 μmol /L celecoxib;F: Altered protoscoleces after 3 days p. i. with 150 μmol /L celecoxib; G: Altered protoscoleces after 1days p. i. with 200 μmol /L celecoxib;H: Altered protoscoleces after 3 days p. i. with 200 μmol /L celecoxib

图1 光镜细粒棘球绦虫原头节的(100×)(0.1%伊红染色)

Fig.1 Light microscopy of E. granulosus protoscoleces(100 ×)

从活力曲线图(图2)看出，随着药物浓度的增加和用药时间的延长，塞来昔布对原头节的抑制率增加，即药物对原头节的抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性。

图2 不同浓度塞来昔布作用后细粒棘球蚴原头节活力曲线

Fig.2 Survival ofE.granulosusprotoscoleces afterinvitroexposure to celecoxib

3.3 塞来昔布对p-ERK2蛋白表达的影响 Western blot法检测DMSO及100、150、200 μmol/L塞来昔布作用原头节48 h后 P-ERK2蛋白表达(图3),以ERK磷酸化程度作为评估塞来昔布对原头节体内该信号通路活性影响的指标。本实验中测得各组p-ERK2及内参β-actin蛋白的灰度值,以P-ERK2/β-actin灰度比值进行P-ERK2蛋白表达水平的相对半定量分析，显示不同浓度塞来昔布(100、150、200 μmol/L)处理细胞48 h后, p-ERK2蛋白表达量均下降，并呈现明显的浓度依赖性,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 不同浓度塞来昔布作用细粒棘球蚴原头节48 h后磷酸化ERK2蛋白的表达

Fig.3 p-ERK2 protein expression inEchinococcusgranulosusprotoscolices following treatment with celecoxib at different doses for 48h

4 讨 论

新疆是肝细粒棘球蚴病的高发地区[5]，目前该病已被列入国家转移支付项目区免费救治疾病。目前手术治疗是该病的重要治疗方式，但术中头节的外溢难免导致术后复发，因此术中运用有效的局部化疗药物辅助治疗是防止复发的关键措施。目前临床肝包虫术中和术后常用的辅助化学药物有20%的食盐水，10%过氧化氢，1.5%西曲溴铵，0.15%氯己定，阿苯达唑，10%聚维酮碘及95%乙醇等。它们虽然都可以起到杀死原头节的作用，但都存在着很多缺点[5]，因此积极寻找术中抗棘球蚴的新药成为肝包虫术后防止复发研究中的一项重要课题。

塞来昔布(celecoxib)是高选择性COX-2抑制剂[7]，目前被用于各领域的实验及临床的研究中，可以抑制多种肿瘤细胞的生长，促进凋亡[8]。以往人们对塞来昔布作用机制的认识仅限于其能够抑制COX-2的活性，而起到抑制肿瘤细胞生长的作用，但随着人们对其机制认识的不断深入，发现塞来昔布等非甾体类药可以在完全缺乏COX活性的细胞中发挥抑制生长的作用，说明这类药物除抑制环氧合酶的途径外，同时又有其他途径的参与而发挥抑制细胞增殖的作用[9-11]。张 勇[12]等研究证实塞来昔布可通过抑制ERK2信号传导通路而起到抑制胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡的作用。

本研究观察塞来昔布对体外培养细粒棘球蚴原头节生长的影响。从实验结果得知，50、100、150、200 μmol/L的塞来昔布作用原头节后其生长均受到抑制。倒置显微镜下观察各浓度塞来昔布作用后的原头节活动度较DMSO和培养基组对比呈明显下降趋势，说明不同浓度的塞来昔布均对体外培养的细粒棘球蚴原头节均有抑制生长和杀伤作用，并呈明显浓度和时间依赖。

ERK2(细胞外信号调节激酶2)是MAPK信号通路中一条促进细胞生长及抗凋亡的通路，本课题组[13]研究发现ERK抑制剂PD98059体外有抑制原头节生长的作用。本研究结果显示塞来昔布能使细粒棘球蚴原头节磷酸化ERK2表达减少，并有较明显的浓度依赖性，表明塞来昔布能阻断ERK2磷酸化，从而达到抑制细粒棘球蚴原头节生长的作用，间接地表明塞来昔布抑制细粒棘球蚴原头节生长作用与ERK2途径有关，但是否同时有其他作用机制共同参与，值得进一步研究。

塞来昔布于2000年被美国食品药品管理局首次批准用于家族性息肉病的治疗，国内已有塞来昔布用于预防肿瘤的实验研究报道[15]。本研究只是塞来昔布对细粒棘球蚴原头节生长一个初步的探索，但塞来昔布抗细粒棘球蚴原头节的作用机理还不明确，我们将在此基础上进一步深入研究，为临床开辟预防肝包虫术后复发提供新途径。

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Lü Hai-long，Email：lvhl1999@126.com

Effects of celecoxib on viability and the expression of ERK2 inEchinococcusgranulosusprotoscoleces

WANG Bo1,JIANG Yu-feng2,LI Fang-fang1,WANG Zhuo1,XING Guo-qiang1, LEI Ying2,SHI Hong-juan2, ZHANG Shi-jie1,PENG Xin-yu2,LYU Hai-long1

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheFirstAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ShiheziUniversity,Shihezi832008，China; 2.DepartmentofHistologyandEmbryology,SchoolofMedicine,ShiheziUniversity,Shihezi832008，China)

The aim of this study was to explore the celecoxib in the viability ofEchinococcusgranulosusprotoscoleces, and to investigate the expression of extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2). Protoscoleces ofE.granulosuswere incubatedinvitrowith celecoxib at concentrations of DMSO, 50, 100, 150, 200 μmol/L，and the viability of protoscoleces was assessed on a daily basis by microscopic observation of movements, flame cell activity, and 0.1% eosin staining. P-ERK2 expression was determined by Western blot to evaluate the activation of ERK2. Control protoscolices incubated in the DMSO and RPMI 1640 medium were not altered and remained viable (95.5±0.5)% after 7 days of incubation. From day 1,the viability of protoscoleces started to decline due to the 150, 200 μmol/L of celecoxib. After 2 days,viable protoscoleces were no longer observed in cultures treated with 200 μmol/L of celecoxib but survival of (3.1±0.7)%.At 150μmol/L, celecoxib had a clearly decreased efficacy, with (43.9±0.4)% of protoscolices still viable after 3 days of treatment. Protoscolex death increased with time. Only a small fraction of protoscolices were viable in cultures treated with 100 μmol/L celecoxib after 7 days.Although 100mol/L, 50μmol/L of celecoxib had an effect on protoscoleces，the effect was not as pronounced as that of 200 μmol/L of celecoxib. Treatment with celecoxib down-regulated that of ERK2 protein inEchinococcusgranulosusprotoscolices. The date reported in this article demonstrate a clearly that celecoxib satisfactory action againstE.granulosusprotoscolecesinvitro,this effect may relate to the inhibition of ERK2 kinase signaling pathway.

celecoxib；Echinococcusgranulosus；protoscoleces； ERK2 signal pathway

国家自然科学基金资助项目(No. U1303121)资助

吕海龙，Email:lvhl1999@126.com

1.石河子大学医学院第一附属医院肝胆外科，石河子 832008; 2.石河子大学医学院组织胚胎学教研室，石河子 832008

Supported by the National Natural Science Foundation of China( No. U1303121)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.013

R383.33

A

1002-2694(2015)06-0556-04

2015-01-15；

2015-03-14