2009-2012年河北鼠型斑疹伤寒流行概况及实验室调查分析

孙印旗 ，董 妥，姜 霞，王 勇，钱振宇，刘晓丽 ，张丽娟

2009-2012年河北鼠型斑疹伤寒流行概况及实验室调查分析

孙印旗1，董 妥2,3，姜 霞1，王 勇2,4，钱振宇1，刘晓丽1，张丽娟2

目的 对2009-2012年河北省斑疹伤寒高发地区临床报告病例进行实验室调查分析。方法 按我国卫生部《流行性和地方性斑疹伤寒诊断标准》(WS 215-2008)在临床可疑病例高发地区设立哨点监测医院并收集病例。临床病例进行个案登记并进行发病急性期及恢复期血液标本的收集。实验室检测按WHO推荐的立克次体血清学诊断方法-间接免疫荧光法检测病人血清IgM和IgG特异抗体。以急性期血液DNA为模板，采用巢氏PCR扩增斑疹伤寒群立克次体热休克蛋白基因groEL基因并测序。通过NCBI Blast平台同源比较序列并使用DNASTAR软件进行遗传进化分析。结果 本次调查在辛集市、定州市和迁安市共收集877例临床报告病例，2009年报告病例数最多(441例)，迁安市病例数最多(510例)。急性期血清莫氏立克次体IgM抗体阳性率为 72.8%(73/101)，IgG阳性率为 78.2%(79/101)。12人通过血清IgG抗体4倍升高或降低明确诊断。PCR扩增阳性率为21.7%(22/101)，成功测序的17人groEL(209 bp)基因100%同源，与其他地区序列存在较大变异，与标准株R.typhiWilmington (AY191590)核苷酸97.0%，氨基酸只有93.9%同源,进化分析与其他菌株遗传关系较远。结论 河北省辛集、定州和迁安地区存在鼠型斑疹伤寒流行。进一步调查传播媒介及宿主对该病的预防控制具有重要公共卫生意义。加强该病临床诊断及鉴别诊断十分必要。

鼠型斑疹伤寒；莫氏立克次体；groEL基因；分子流行病学特征

斑疹伤寒是古老立克次体病之一，历史上曾给人类带来深重灾难，尤其是战争、贫困、自然灾害及社会动荡等因素极易造成该病的流行[1-2]。半个世纪以来，我国曾发生超过万人以上3次大流行[3]。新中国成立后，该病列为法定传染病乙类管理。斑疹伤寒主要分为体虱传播的流行性斑疹伤寒和鼠蚤传播的鼠型斑疹伤寒(也称地方性斑疹伤寒)。随着经济水平的提高，前者在我国基本得到控制，而后者仍在广大农村地区流行。2010年云南瑞丽某监狱戒毒人员蚤传斑疹伤寒暴发流行，76人感染发病，这是我国近年最大规模的一次流行[4]。河北省是我国斑疹伤寒主要流行区[5]，历史上几次大流行都波及该省。2009-2012年，该省石家庄、保定和唐山市临床单位报告可疑斑疹伤寒病例明显增多，但缺乏实验室依据。对此，河北省CDC与中国CDC传染病预防控制所合作开展了实验室调查分析。

1 材料与方法

1.1 病例定义与标本采集 在河北省斑疹伤寒高发的石家庄、保定和唐山市，分别在其下辖的高发县辛集市、定州市和迁安市，选择辛集市新集镇卫生院，定州市人民医院，迁安市建昌营医院、和迁安市杨各庄医院作为监测哨点医院，根据中华人民共和国《流行性和地方性斑疹伤寒诊断标准》(WS 215-2008)，临床表现符合斑疹伤寒，实验室外斐试验OX2或OX19≥ 1∶160。 收集病例包括门诊病例和住院病例。个案调查及信息采集包括年龄、性别、职业、住所、野外作业及虫媒叮咬史、主要临床表现及治疗等信息。同时采集急性期和恢复期(间隔至少2～3周)非抗凝血2 mL，分离血清及血块并-20 ℃或-40 ℃保存，后送中国CDC传染病预防控制所无形体室进行实验室检测。

1.2 实验室分析

1.2.1 血清学检测 发热期及恢复期血清标本同批次检测莫氏立克次体IgM和IgG抗体。采用WHO立克次体协作中心推荐的间接免疫荧光方法(IFA)[6]。R.typhiWilmington菌株抗原为本室保存。为鉴别诊断，血清还同时检测了虱传流行性斑疹伤寒立克次体R.prowazekii、蚤传斑点热群立克次体R.felis、横赛巴尔通体B.henselae、螨传恙虫病东方体O.tsutsugamushi、蜱传黑龙江立克次体R.heilongjiangenesis及Q热病原体-贝氏考克斯体C.burnetii。鉴别诊断菌株为WHO立克次体协作中心惠赠(法国马赛)。 试验简述为：血清用3%脱脂奶粉PBS按临界值1∶40(IgM)和1∶80(IgG)稀释，适当加到抗原孔内，37 ℃作用45 min，PBS土温洗涤2次，每次10 min，水洗5 min。每孔加适量伊文斯蓝稀释抗人IgM或IgG(美国KPL公司)抗体,37 ℃作用45 min后，按前述方法洗涤烘干，加缓冲甘油，盖玻片密封后荧光镜检。正常人混合血清及斑疹伤寒病人血清分别为阴性及阳性对照。病人阳性标本进一步稀释半定量试验。

1.2.2 热休克蛋白groEL基因扩增与序列分析 使用德国QIAGEN公司DNA提取试剂盒(Cat. No. 69506) 对病人急性期血块DNA提取，按说明书操作。本室保存的莫氏立克次体L929细胞培养物及无菌水同步操作分别作为阳性对照及阴性对照。巢式PCR[8]外引物对 Gro-1：5′- AAG AAG GA/CGT GAT AAC-3′； Gro-2：5′-ACT TCA/CGT AGC ACC-3′；内引物对SF-1：5′-GATAGAAGAAAAGCAATGATG-3′； SR-2：5′-CAGCTATTTGAGATTTAATTTG -3′。1轮反应条件：94 ℃预变性5 min，39循环:94 ℃变性40 s：45 ℃退火40s ，72 ℃延伸40 s。反应72 ℃总延伸4 min。2轮反应条件：94 ℃预变性5 min，39循环:94 ℃变性35 s：56 ℃退火35 s ，72 ℃延伸35 s，最后72 ℃总延伸4 min。预期片段为217 bp。PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司双向测序。Blast同源比较后，对差异碱基人工核实，必要时送第二家公司测序核实。选择不同地区，不同宿主来源序列做进化分析。进化分析采用DNAstar MegAlign5.0(DNASTAR Inc.USA)软件。

2 结 果

2.1 病例收集及流行病学资料 按《流行性和地方性斑疹伤寒诊断标准》,2009—2012年共收集877例临床诊断病例(图1)。男481例，女396例， 平均年龄20.33岁(年龄中位数12.03岁)，其中15岁以下人群发病占53.9%(473例)；职业以农民为主，共309例(占35.2%)，其次为散居儿童266例(占30.3)、学生164例(占18.7%)和托幼儿童91例(占10.4%)。辛集市、定州市和迁安市分别报告155例、212例和510例和。2009年报告病例最多，为441例。调查地区以迁安市病例数最多，共报告510例。病例均为不明原因高热排除其他可能急性传染病病例。对87例病例个案调查结果显示，病人临床症状较轻，除1例外，其他都无并发症，经抗立克次体治疗后全部痊愈，未出现死亡。97.9%(85/87)病例发病前20 d内无外出史，也没有相关病例接触史。

图1 2009-2012年河北省斑疹伤寒调查地区临床病例分布

Fig.1 Incidences of clinical diagnostic murine typhus from Hebei Province, 2009-2012

2.2 血清学检测结果 877病例中，101人采集到急性期血液，17人(迁安12人，定州市5人)采集到恢复期血液。当地医院对急性期血清进行外斐试验33例OX2≥ 1∶160；68例OX19≥ 1∶160。本调查IFA急性期血清莫氏立克次体IgM抗体阳性率为 72.8%(73/101)，平均几何滴度GMT为104。最高滴度为1∶320， IgG阳性率为 78.2%(79/101)，平均几何滴度GMT为180,最高滴度为1∶640，在17份恢复期血清中，7人IgG抗体4倍升高，最高1∶1 280。5人IgG抗体4倍降低，最低1∶20。故12人血清学明确诊断，而另5人IgG抗体阳性没有发生4倍改变。此外，血清标本还进行了流行性斑疹伤寒群立克次体R.prowazekii、蚤传斑点热立克次体R.felis、蚤传横赛巴尔通体B.henselae、螨传恙虫病东方体O.tsutsugamushi、蜱传黑龙江立克次体R.chaffeensis和Q热病原体-贝氏考克斯体C.burnetii抗体检测，结果显示上述抗体在临界值滴度没有发现与莫氏立克次体有交叉反应。

2.3 PCR扩增及序列分析 101例病人急性期血液DNA， 22人巢氏PCR扩增阳性,这22人急性期血清IgM抗体均阳性， 7例血清诊断病例。22例PCR阳性产物，17人(辛集10人、迁安2人，定州市5人)测序成功。序列比较发现，该地区检测到的莫氏立克次体热休克蛋白基因(209 bp)100%同源。然而，该基因与GenBank其他地区序列有较大变异，与国际标准株R.typhiWilmington (AY191590)核苷酸97.0%同源，氨基酸只有93.9%同源。与R.typhiWilmington比较，有11处核苷酸发生改变,包括331-333位置的AAA被TCT置换、334/442/497位置的G/G/T被A/T/C取代。339位缺失A，而391/419/441/442插入T/C/C/G。进化分析显示，该地区莫氏立克groEL基因与其他分离株关系较远(图2)。

图2 河北地区R.typhii groEL基因进化分析

Fig.2 Phylogenetic analysis ofR.typhiigroELgenes identified in Hebei Province

3 讨 论

尽管斑疹伤寒是一古老立克次体病，但在世界贫困地区及某些发展中国家仍有暴发流行[8]，如1995年的喀麦隆曾发生流行性斑疹伤寒。我国近年最大规模的暴发流行就是云南瑞丽某监狱发生的地方性斑疹伤寒[4]。该病不仅是东南亚地区重要立克次体病之一[9-11],也是旅游人群获得性感染的重要急性发热性疾病[12]。

按美国CDC立克次体诊断标准，本调查明确了27例河北3地临床报告斑疹伤寒实验室诊断(15例分子生物学确诊及12例血清学诊断)，占临床报告病例的26.7%(27/101)。尽管急性期IgM抗体阳性率高达 72.8%(73/101)，然而，目前国际同行对该抗体在诊断中的作用还没有统一认识，如果按我国现行标准，实验室确诊病人将提高一倍。通过本调查，我们认为外斐试验仍具有一定的初筛诊断价值。分子流行病学调查发现该地莫氏立克次体groEL基因与国际标准株R.typhiWilmington无论核苷酸还是氨基酸均有较大变异。作为高温环境应急蛋白，groEL基因与立克次体致病性相互关系还不清楚。

本调查无论从临床还是实验室分析均确证了河北斑疹伤寒的存在。加强该病的认识及必要的实验室诊断及鉴别诊断，对病人及时治疗,避免多器官受累,病死率增加具有一定的临床意义。疾病监测组织有必要进一步开展宿主及媒介监测，为有效防控提供必要的科学依据。加强宣传，提高民众对该类疾病的预防知识，如家居环境灭鼠、防止鼠蚤叮咬等均可降低该病患病风险。

(致谢：本文对辛集市新集镇卫生院，迁安市建昌营医院、迁安市杨各庄医院，定州市人民医院等监测哨点医院的工作人员对病例收集及标本采集等表示感谢，对迁安市、定州市及辛集市疾病预防控制中心所有参与现场调查人员及直属乡镇卫生院防疫人员对该项工作给与的支持与帮助一并表示感谢。)

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Epidemiological characterizes and laboratory investigation of endemic typhus in Hebei Province, 2009-2012

SUN Yin-qi1,DONG Tuo2,3,JIANG Xia1,WANG Yong2,4,QIAN Zhen-yu1,LIU Xiao-li1,ZHANG Li-juan2

(1.CenterforDiseaseControlandPreventionofHebeiProvince,Shijiazhuang050021,China; 2.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China; 3.SchoolofPublicHealth,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China; 4.CollegeofAnimalScience&Technology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China)

In case of increasing the number of murine typhus cases from hospitals in Hebei Province, a joint investigation was conducted by the National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, China CDC and Centers for Disease Control and Prevention of Hebei Province during 2009-2012. Based on the criteria of "Diagnostic criteria for epidemic typhus and endemic typhus (WS215-2008)" issued by Ministry of Health of The People's Republic of China on Feb 28, 2008, 877 clinical diagnostic cases were recruited from Xinji City, Dingzhou City and Qianan City and 101 blood samples from acute stage of illness and 17 blood samples from convalescence of illness were collected respectively, IgM and IgG antibodies againstRickettsiatyphiin sera were tested by immunofluorescence assays (IFA). Nested PCR targetedR.typhigroELgene was performed using acute stage blood clots DNA as temples and phylogenetic analysis was conducted based on thegroELgene. Epidemiological data indicated the highest annual incidence was 2009 with 441 cases and the highest areas were Qianan City with 510 cases. Of the acute phase sera, 72.8% (73/101) were IgM positive and 78.2% (79/101) were IgG positive. A 4-fold seroconversion in the IgG antibody titer was observed in 12 patients (4-fold increase in 7 patients and 4-fold decrease in 5 patients). The 21.7% (22/101) of acute stage blood clot DNA were nested PCR positive. Sequence analysis showed the partial sequence ofgroELgenes from 17 patients were 100% identity for each other. Compared with the reference stainR.typhiWilmington (AY191590), only 97.0% of nucleotide homology and 93.9% amino acid homology were noticed and phylogenetic analysis indicated thegroELgenes tested in the study were far from other sequences identified in other areas of the world. Here, we concluded that the reemerging murine typhus was confirmed in most areas of Hebei Province, China, and diagnosis and differential diagnosis of theR.typhiinfection should be emphasized in hospitals.

murine typhus;Rickettsiatyphi;groELgene; molecular characterizes

国家973计划基础研究项目(No.2010CB530206) 及“十二五”传染病重大专项课题(No.2008ZX10004-008、No.2012ZX10004215)联合资助。(孙印旗，董妥有同等贡献)

张丽娟， Email:zhanglijuan@icdc.cn

1.河北省疾病预防控制中心,石家庄 050021; 2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京 102206; 3.哈尔滨医科大学公共卫生学院，哈尔滨 150081; 4.新疆石河子大学动物科技学院,石河子 832003

Supported by the National Basic Research Program of China (973 Program No. 2010CB530206) and the National Key Science and Technology Projects of China (Nos. 2008ZX10004-008 and 2012ZX10004215)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.012

R376

A

1002-2694(2015)06-0552-04

2015-02-28；

2015-03-30