氟尿嘧啶诱导大鼠卵巢损伤模型

王 盈，张鹏飞，王建刚，席守民，田晓予

氟尿嘧啶诱导大鼠卵巢损伤模型

王 盈1，张鹏飞1，王建刚2，席守民2，田晓予1

目的 探讨氟尿嘧啶(5-Fu)诱导的大鼠卵巢损伤模型建立的方法和时间。方法 将8～9周SD大鼠分为4组：生理盐水对照组、5-Fu低剂量组、中剂量组、高剂量组，各组分别接受生理盐水和5-Fu：每天1 mL/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg腹腔注射，连续14 d。通过大鼠动情周期、血清AMH、FSH和E2的水平和卵泡计数情况来判断建模效果。结果 低、中、高剂量组大鼠动情周期出现紊乱。停药后第1天，与生理盐水对照组相比，血清AMH浓度低、中、高剂量组明显降低 (P<0.05)；中、高剂量组血清雌二醇降低(P<0.05)；低、中、高剂量组血清FSH浓度明显升高 (P<0.05)；低、中、高剂量组卵巢湿重减少明显(P<0.05)，生长卵泡和原始卵泡计数明显减少 (P<0.05)。结论 5-Fu能够损伤大鼠的卵巢功能，引起血清E2、FSH和AMH水平的改变，且在反应卵巢损伤时AMH可能较FSH和E2更灵敏。

氟尿嘧啶；卵巢早衰；大鼠；抗苗勒管激素

化学药物治疗是免疫性疾病和恶性肿瘤的重要治疗手段，随着人们不断研发新药并应用，大大提高了育龄期癌症妇女的生存率[1-2]，甚至治愈早期患者。但是绝大部分患者在接受化疗的同时，也遭受了化疗药物带来的毒性作用。随着肿瘤发病的年轻化、女性好发免疫性疾病的特征，化疗对年轻女性肿瘤患者的生殖系统损伤越来越不容忽视。研究证实：化疗药物可以损伤女性卵巢，出现卵巢功能不全、月经失调甚至不孕不育，如化疗致闭经，甚至卵巢早衰等，严重影响着有生育渴望的年轻女性肿瘤患者的生活质量及身心健康[3-4]。因此，研究如何保护年轻女性病人的卵巢不受化疗损伤是目前医生和病人都高度重视的问题之一。其中国内外对环磷酰胺(CTX)和顺铂(CDDP)诱导的卵巢早衰动物模型研究较多，考虑到氟尿嘧啶类药物在肿瘤中的应用，本研究查阅相关文献进行了5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导SD大鼠卵巢功能损害的预实验。

1 材料和方法

1.1 动物来源 清洁级雌性SD(sprague-dawley)大鼠，体质量(200±30) g，周龄8～9周，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心[许可证号：SCXK(鄂)2010-0007]。全价颗粒饲料喂养。自由摄食，室温20～25℃，相对湿度45%～55%，每日光照12 h。

1.2 试剂和药物 大鼠抗苗勒管激素(Anti-Miilerian hormone, AMH)测定所用ELISA试剂盒购自艾莱萨试剂有限公司，大鼠血清卵泡刺激素(FSH)和雌二醇(E2)测定用西门子化学发光法检测。5-Fu产自上海旭东海普药业有限公司。

1.3 化疗药物致大鼠卵巢损伤模型的建立 实验开始前，饲养大鼠1周熟悉环境。阴道脱落细胞学涂片，选取有正常性周期的20只大鼠进入实验并分组：20只大鼠随机分成4组：正常对照组(5只)、5-Fu低剂量组(5只)、5-Fu中剂量组(5只)、5-Fu高剂量组(5只)。实验开始时剪尾取血，低速离心后取上层血清，-20℃保存用于检测同批性激素。正常对照组：给予0.5 mL生理盐水皮下注射，1次/d，一共15次。 5-Fu低、中、高剂量组：分别以每天5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg的剂量连续腹腔注射14 d，各组均于停药后第1天和第15天剪尾取血并于发情间期分批处死大鼠，制作卵巢标本。

1.4 动情周期的监测 每日早上7∶30～8∶30进行阴道分泌物涂片，显微镜下观察大鼠性周期并记录。

1.5 大鼠卵巢的处理 称体质量后剪尾取血，后戊巴比妥钠麻醉解剖，沿两侧输卵管找到卵巢，摘取卵巢并称其湿重。一侧卵巢-80℃保存，另一侧中性甲醛固定，石蜡包埋，连续5 μm切片10张，HE染色后于光镜下进行卵泡计数，卵泡分级标准：原始卵泡直径约20～30 μm，由卵子及环绕其周围的单层梭形颗粒细胞组成；生长卵泡直径约30～700 μm，由卵子及环绕其周围的单层至复层柱状颗粒细胞组成。包括初级卵泡、次级卵泡；窦前卵泡、早期窦卵泡。为了避免重复计数和将闭锁的卵泡排除在外，只有在光镜下看到卵泡中有卵子存在时才计数在内。

1.6 大鼠血清的提取与保存 血液冰上静置30 min后，3 000 r/min，4℃，离心10 min，取上层血清，-20℃保存备用。

2 结果

2.1 一般情况 低、中、高剂量组的大鼠在给予5-Fu后，活动较少，体毛暗淡无光泽甚至脱毛，随着累积剂量的增加，脱毛现象越来越严重。停药后新毛长出，恢复正常。给药第7天，低剂量组20%(1/5)出现腹泻，中剂量组60%(3/5)出现腹泻，高剂量组100%(5/5)出现腹泻。除生理盐水组外其余各组大鼠均出现小便增多情况，且饮食量也明显减少，低、中、高3组平均饮食量分别为15 g/只、12 g/只、9 g/只。在观察期间，低、中剂量组大鼠均存活，高剂量组20%的大鼠死亡(1/5)。

2.2 实验前后大鼠体质量比较 低、中、高剂量组的大鼠在给予5-Fu后第3天体质量开始下降，随剂量增加下降趋势更明显。结束给药后第1天，实验组大鼠体质量均降至最低点，以后体质量虽有所增长，但观察至2周时仍未彻底恢复(P<0.05)，见图1。

图1 各组大鼠的体质量变化趋势图

2.3 大鼠血清激素水平检测 实验前，低、中、高剂量组大鼠的血清FSH、E2、AMH与对照组相比均无明显差异(P>0.05)，见表1。停药第1天，低、中、高剂量组血清各项性激素均出现不同程度改变，FSH升高明显(P<0.05)， AMH降低明显(P<0.05)，而E2虽然有所降低但并不明显(P>0.05)，见表2。停药第15天，低、中、高剂量组血清各项性激素均明显改变(P<0.05)，见表3。实验各组血清FSH前后比较，生理盐水组和低剂量组没有明显变化，停药第1天和第15天，中、高剂量组均变化明显(P<0.05)，而停药第1天和第15天相比没有明显差别(P>0.05)，见表4。实验各组血清E2前后比较，生理盐水组没有明显变化，停药第1天低、中、高剂量组均变化明显(P<0.05)；而第15天，低剂量组E2水平有所恢复，中、高剂量组却没有恢复，且停药第1天和第15天相比没有明显差别(P>0.05)，见表5。实验各组血清AMH前后比较，除生理盐水组没有明显变化，停药第1天和第15天，低、中、高剂量组均变化明显(P<0.05) ，而第1天和第15天相比没有明显差别(P>0.05)，见表6。

2.4 卵巢湿重分析 实验各组大鼠卵巢湿重比较：停药第1天，低、中、高剂量组卵巢湿重均有所下降(P<0.05)，但不是非常明显；停药第15天，低、中、高剂量组卵巢湿重均下降明显(P<0.05)。组间前后比较，只有高剂量组差异明显(P<0.05)，见表7。

表1 实验前大鼠的血清激素水平检测±s)

注：FSH：F=0.127，P=0.943；E2：F=0.465，P=0.710；AMH：F=0.916，P=0.511。

表2 停药第1天大鼠的血清性激素水平±s)

注：FSH：F=8.773，P=0.027；E2：F=0.864，P=0.632；AMH：F=15.340，P=0.000。

表3 停药第15天大鼠的血清性激素水平±s)

注：FSH：F=7.680，P=0.010；E2：F=12.179，P=0.002；AMH：F=13.871，P=0.001。

表4 大鼠血清FSH水平的前后比较 mIU/mL

注：①停药第1天与实验前相比，P值分别为0.275，0.006，0.001；②停药第15天和实验前相比，P值分别为0.426，0.027，0.002；③停药第1天与第15天相比， P值分别为0.312，0.505，0.943。

表5 大鼠血清E2水平的前后比较 pg/mL

注：①停药第1天与实验前相比，P值分别为0.023，0.000，0.000；②停药第15天和实验前相比，P值分别为0.229，0.000，0.000；③停药第1天与第15天相比，P值分别为0.322，0.446，0.109。

ng/mL

注：①停药第1天与实验前相比，P值分别为0.002，0.001，0.000；②停药第15天和实验前相比，P值分别为0.007，0.010，0.001；③停药第1天与第15天相比，P值分别为0.834，0.418，0.558。

表7 大鼠的卵巢湿重比较 g

注：停药第1天：F=8.108，P=0.036；停药第15天：F=32.756，P=0.000。

2.5 卵巢卵泡计数情况 实验各组大鼠生长卵泡计数：停药第1天，低、中、高剂量组生长卵泡均明显下降(P<0.05)；停药第15天，低、中、高剂量组生长卵泡虽有所恢复，但明显低于生理盐水组细胞(P<0.05)。组间停药第1天和第15天相比较，没有明显差异(P>0.05)，见表8。原始卵泡计数：停药第1天，低、中、高剂量组生长卵泡均明显下降(P<0.05)；停药第15天，低、中、高剂量组生长卵泡虽有所恢复，但明显低于生理盐水组细(P<0.05)。组间停药第1天和第15天相比较，没有明显差异(P>0.05)，见表9。

表8 大鼠的生长卵泡统计情况±s)

注：停药第1天：F=44.697，P=0.000；停药第15天：F=32.659，P=0.000。

表9 大鼠的原始卵泡统计情况±s)

注：停药第1天：F=10. 675，P=0.022；停药第15天：F=39.49，P=0.000。

3 讨论

卵巢早衰是指月经初潮正常或青春期延迟，第二性征发育正常的妇女在40岁前因某种原因引起的提前绝经。其主要表现在继发性闭经、高促性腺激素和低雌激素状态[5]。郭奕倩[6]等学者研究指出，烷化剂(包括环磷酰胺、氮芥等)对卵巢功能的损害作用最大，顺铂、阿霉素的毒性作用居中，而氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、放线菌素D等化疗药物对卵巢的毒性作用可能最小。CTX和CDDP的研究中观察到小鼠激素水平下降、卵巢间质纤维化、闭锁卵泡增加等[7-9]。本研究发现，注射5-Fu后，大鼠出现精神萎靡、食欲下降、饮水量增加；皮毛光泽度下降，甚至出现脱发现象，中高剂量组尤甚；动情周期紊乱，正常4～5 d的动情周期可延长至8～10 d，甚至一直处于动情间期。给药14 d后，取卵巢组织，可见卵巢充血、水肿甚至坏死，停药14 d后，大鼠卵巢体积缩小甚至出现萎缩，失去正常形态。组织HE染色后观察到的卵巢组织结构紊乱，间质纤维化，出现空泡样改变，生长卵泡数目明显减少，成熟卵泡少见，卵泡内颗粒细胞层减少，可见大量闭锁卵泡，滤泡内可见淋巴细胞浸润。

基础FSH值升高可能会造成卵泡发育不良，故血清FSH作为监测女性化疗患者是否发生卵巢早衰的常用指标，并用来评估卵巢组织的损伤程度。化疗后闭经时间持续达12个月以上，血清基础FSH值≥30 IU/L可作为诊断卵巢早衰的依据。徐琳[10]等人研究发现，顺铂高剂量组较低剂量组和对照组而言，月经周期第3天的血清FSH水平均升高，差异均有统计学意义。但这种变化只是在化疗药物累积剂量达半数致死量时方表现出来，这说明血清FSH水平在评估卵巢功能早期衰退时并不可靠，它需要卵巢损害达一定程度时才可能发生明显变化。

AMH属转化生长因子-β( Transforming Growth Factor,TGF-β) 超家族。主要由次级卵泡、窦前卵泡和小窦状卵泡(直径<4 mm)分泌，初级卵泡弱表达，始基卵泡和大窦状卵泡中不表达[11-14]。它的生殖功能比较复杂，只有性腺组织能够表达[15]，而且表达有一定的时间和空间特异性。

研究显示：AMH可作为评价人类卵巢储备的有效指标之一[16-17]。血清AMH水平已经在不孕症的诊治中用于评价卵巢储备、卵巢反应性和卵巢的年龄等[18]。而且人类血清AMH水平跟年龄具有相关性[19]。给予低剂量顺铂的大鼠，当血清AMH水平已明显下降时，血清FSH水平几乎无变化；当顺铂剂量达到其半数致死量时，血清FSH 水平才出现升高。AMH早于FSH的改变，说明作为监测化疗损伤性卵巢早衰发生的最早期血清学指标是AMH，而不是FSH。AMH是随着女性年龄增长最早发生变化的激素，对与年龄相关的生育能力下降有更好的评估价值。研究正常排卵的女性发现，经期第3天较FSH、INHB、E2等反应窦卵泡数量而言，AMH变化更早更准确[20]。还有研究指出[21-22]：IVF患者体内，当FSH低于10 IU/L时，AMH评估卵巢低反应较FSH更灵敏，甚至可以比年龄更准确地预测更年期时间。

E2来源于颗粒细胞，是反映卵巢功能的直接指标。当卵巢功能发生变化时，AMH水平最先发生改变，其次是E2水平发生变化，最后才是FSH水平的改变[23]。本研究结果也发现，在低剂量组大鼠体内，AMH较FSH和E2而言最先发生变化。在本次建立模型的过程中，作者发现给予5-Fu后SD大鼠体内的AMH、E2和FSH都有所改变。停药时，低中高3组大鼠体内E2、AMH水平均降至最低，而FSH升高明显；停药2周较刚停药而言，虽各组E2和AMH较升高，FSH有所降低，除低剂量组接近正常水平外，中高剂量组并不能恢复到原来水平；卵泡计数情况也证实了这些激素水平的改变。这说明化疗药物对卵巢的损害是不可逆转的。

综上所述，中剂量组的给药方案为较理想的建模方案，该模型能够模拟卵巢早衰的病理生理及发病过程，且费用低廉、成模时间短、成功率高、模型较稳定，可作为探讨卵巢早衰发病机制的动物模型。由于样本量较少，可能还需扩大样本量实验获得更可靠的结果。

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Establishment of Rat Model of Fluorouracil-induced Premature Ovarian Damage

WANG Ying, ZHANG Peng-fei,WANG Jian-gang,et al

(First Affiliated Hospital, Henan University of Science & Technology, Luoyang 471003, China)

ObjectiveTo investigate the applicable method and optimal time in establishment of the animal model for fluorouracil-induced ovarian damage.Methods8-9week-old SD female rats were divided into four groups:normal saline control, low-dose 5-Fu, middle-dose 5-Fu, high-dose 5-FU. The rats in four groups were received daily intraperitoneal injection of normal saline and 5-Fu,1 mL/kg,5 mg/kg,10 mg/kg,20 mg/kg,respectively for two weeks. We detected vaginal smears,wet ovaries wet weighted, and the levels of estradiol (E2), follicle-stimulating hormone (FSH) and anti-Müllerian hormone (AMH) in blood to value the effect of 5-Fu.ResultsThe estrus cycle of rats was remarkably disordered in the BCD groups. It suggested that, compared to A, the level of AMH was significantly decreased((P<0.05)in groups BCD，the level of E2 was also decreased (P<0.05) in groups CD. While the concentration of FSH was heavily increased after 5-FU administration(P<0.05).The wet weight and follicle numbers were also decreased(P<0.05).Conclusion5-Fu can damage the ovarian and changes the levels of AMH,E2,and FSH. AMH may be more sensitive than E2 and FSH in response to ovarian damage.

5-Fu；premature ovarian failure；rats；anti-mullerian hormone

2015-01-29

1.河南科技大学第一附属医院，河南洛阳 471003 2.河南科技大学医学院，河南洛阳 471003

王盈(1987-)，女，蒙古族，河南南阳人，从事妇科肿瘤的基础与临床研究。

田晓予，女，博士，教授，E-mail：tiaoxiaoy1210@163.com

R711.75

A

1672-688X(2015)01-0014-05