低温对番茄果实转色关键酶的影响

刘雪静 王艳 刘童光 张其安 方凌 段宝慧

摘 要： 为了研究低温对番茄果实转色关键酶的影响，以‘T-CRH-13番茄高世代稳定自交系为材料，采用紫外分光光度计法检测常温和低温条件下番茄果实成熟过程中番茄红素含量的变化，并利用实时荧光定量PCR分析了番茄红素合成相关酶（PSY1、PSY2、PDS、ZDS）基因的表达变化。结果表明：在果实成熟过程中，低温处理组和对照组的番茄红素含量都呈增高趋势，处理组番茄红素积累缓慢，且含量远低于对照组;处理组和对照组的PSY1、PSY2表达量都是先增高后降低，对照组的表达量明显高于处理组;处理组和对照组的ZDS变化趋势一致，都是先降低后增高;处理组的PDS先降低后升高，总体呈降低趋势，对照组持续升高。低温下，番茄红素合成相关酶基因表达受抑制，番茄红素合成和积累水平降低可能是番茄转色困难的重要原因。

关键词： 番茄; 低温; 番茄红素; 关键酶

Effect of chilling temperature on key enzyme in tomato in colour- changed period

LIU Xuejing1， WANG Yan2， LIU Tongguang1， ZHANG Qian2， FAGN Ling2， DUAN Baohui1

（1. School of Horticulture，Anhui Agricultural University， Hefei， 230036， China; 2. Anhui Academy of Agricultural Sciences， Institute of Horticulture， Hefei， 230031， China）

Abstract： In order to study the effect of chilling temperature on key enzyme in Tomato in colour-changed period，the contents of lycopene during tomato fruit development were measured. The expression of PSY1 and PSY2 and PDS and ZDS gene participated in lycopene synthetic were quantitative by real-time quantitative PCR. The results showed that the content of lycopene gradually increased in tomato fruit ripening process，lycopene accumulated slowly in treatment group，and the content was far lower than the control group;the expression levels of PSY1 and PSY2 increased during the mid-stages but decreased in the fully mature fruit and the expression level of control group was obviously higher than that of treatment group; the expression levels of PDS decreased during the mid-stages but increased in the fully mature fruit;the expression levels of ZDS decreased during the mid-stages but increased in the fully mature fruit in treatment group，the expression levels of the control group gradually increased. Under the condition of low temperature，the expression of gene participated in lycopene synthetic is suppressed，the drop of synthesis and accumulation of lycopene levels may be the important reason for the difficult in colour-changed in tomatoes.

Key words： Tomato; Chilling temperature; Lycopene; Key enzyme

番茄（lycopersicum esculentum Mill. ）是全世界栽培最为普遍的果菜之一，果实营养丰富，富含类胡萝卜素、维生素C等多种营养素，风味独特，能清热止渴、养阴凉血等。其中，番茄红素（Lycopene）是番茄果实中含量最高的一种类胡萝卜素，具有很强的抗氧化能力，能有效地清除体内自由基，可提高免疫力、延缓衰老、预防心脑血管疾病和一些癌症，因此有“植物黄金”之称，被誉为“21世纪保健品的新宠”。成熟番茄果皮颜色分为无色和黄色，其色素主要为胡萝卜素;果肉颜色为红色和黄色，其中红色果肉含番茄红素，黄色果肉含胡萝卜素;无色果皮与红色果肉其果实颜色表现为粉红，黄色果皮与红肉其果色表现为红色[1]。粉红色及红色番茄在生产上占据主导地位，番茄红素含量是决定此类番茄果实外观色彩的最主要类胡萝卜素。

目前，植物番茄红素生物合成途径已经阐明，其中的关键酶基因也已经被克隆[2]，并应用于植物类胡萝卜素调控的研究[3-4]。番茄红素的生物合成受到遗传和环境因子的共同调控，也受到许多内源分子如光敏色素、乙烯的调节[5]。温度对番茄红素合成的影响和对果实形成的影响相似，当温度低于10 ℃或高于30 ℃ 时，番茄红素的合成受到抑制[6]，当温度降到14 ℃ 以下时番茄红素的合成活性显著下降，在温度高于32 ℃ 时活性被完全抑制，在18～26 ℃之间合成活性最高[7]。

番茄低温转色难，是番茄生产上一直存在的问题，严重影响了果实外观品质和营养价值。前人对番茄转色的关键色素——番茄红素的相关研究虽深入持久，但缺乏对低温条件下番茄红素代谢相关的酶基因的动态变化的系统研究。本研究通过分析番茄果实发育过程中番茄红素合成相关酶基因的变化情况，以期找出低温条件下影响番茄红素含量的关键物质（酶），为针对性地调控相关物质或相关酶，最终解决低温条件下番茄转色慢这一对生产造成严重影响的难题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

‘T-CRH-13番茄高世代稳定自交系来源于安徽省农业科学院园艺研究所育种室。

1.2 试验方法

供试材料在2013年8月1日播种于安徽省农业科学院园艺研究所试验地，穴盘育苗，8月30日定植。试验分为试验组和对照组，试验组大棚栽培，对照组栽培于空调室，保持白天25 ℃，夜间17 ℃。栽培管理水平一致。番茄果实成熟期分为5个时期：青熟期（绿熟果），果实基本停止生长，果顶白，尚未着色;转色期（顶红果），果顶部由绿白色转为淡黄至粉红色;半熟期（半红果），果实表面约一半着色;坚熟期（红熟的硬果），整果着色，肉质较硬;完熟期（软熟期），果实全部着色，肉质变软。果实进入青熟期开始采样，取第2或第3穗果，每个时期取5个果实。分别采用分光光度计法和real-time实时荧光定量法测定番茄红素的含量和酶的相对表达量。

1.2.1 番茄红素的测定 （1）番茄红素的提取与测量：取10 g果实匀浆，加入氯仿萃取，减压滤去组织残渣，并将滤液转移到分液漏斗中，加入氯仿分多次冲洗，定容到50 mL容量瓶中，以氯仿为空白，在518.8  nm测定吸光值，进行番茄红素含量的计算。3次重复。（2）番茄红素标准曲线的绘制：准确称取经真空干燥（45 ℃、30 min）的番茄红素纯品0.35、0.65、0.95、1.3、1.5、1.95、2.05 mg，分别在50 mL容量瓶中用氯仿溶解并定容，在518.8 nm处测其吸光度值，以吸光度值对番茄红素的质量浓度作图，得到番茄红素标准曲线如图 1。

图1 吸光度值对番茄红素质量浓度的标准曲线

1.2.2 基因相对表达量测定 试验样品采集后，迅速用液氮冻存，保存于-80 ℃ 超低温冰箱中备用。研钵和研棒经200 ℃ 烘箱处理8 h，其他试验器材经0.1% DEPC处理12 h，通风橱操作。Trizol法提取RNA。利用M-MuLV反转录酶（宝生物）合成cDNA第一链，步骤如下：

在PCR管中加入总RNA、Random Primer（N）6各1 μL，Rnase-free ddH2O 10 μL，混匀后短暂离心，70 ℃水浴5 min，立即冰浴10 s，短暂离心。在上述混合物中加入5×Reaction Buffer 4 μL、Rnase Inhibitor 1 μL、dNTP 2 μL，混匀后置37 ℃水浴5 min。再加入1 μL M-MuLV Reverse Transcriptase，使终体积为20 μL。将上述混合物置于37 ℃水浴60 min，70 ℃ 孵育10 min终止反应。-20 ℃保存待用。

基因的相对定量分析采用ABI（Applied Biosystems）7500 Real Time PCR System进行，所用引物见表1，每个基因3次重复。以Actin作为内参基因，采用2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量，数据采用Excel和DPS软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 番茄红素的质量浓度与吸光度的关系

由图 1可以看出，番茄红素的质量浓度与吸光度（518.8 nm波长处）的关系为一条直线，其直线方程为c=3.6483A-0.2034，显示出良好的线性关系。

2.2 番茄果实不同成熟期番茄红素含量的变化

番茄果实不同成熟期番茄红素含量的变化见图2，常温和低温条件下，番茄果实中番茄红素含量在发育成熟过程中均逐渐升高。常温下的番茄红素含量明显高于低温下的，且番茄红素积累迅速，并在坚熟期番茄红素积累最快，完熟期番茄红素的含量约是青熟期的32倍。低温下番茄红素积累缓慢，坚熟期积累效率最高，青熟期几乎测不到番茄红素;低温下完熟期番茄红素的积累量约是常温下的1/9，仅与常温下转色期的含量相当。

图2 番茄果实各成熟期的番茄红素含量

2.3 番茄果实不同成熟期的PSY1、PSY2、PDS和ZDS基因表达变化

由图 3可知，PSY1与PSY2基因的表达模式非常相似。常温条件下，从青熟期到半熟期，这2个基因的表达量都是稳步增加，到半熟期表达水平达到最高，然后逐步下降，这为坚熟期番茄红素的快速积累做准备，与番茄红素在坚熟期积累效率最高相吻合。PSY1与PSY2在低温条件下表达模式同常温下类似，也是先增加后减少，只是在完熟期略微上升。但是，在低温条件下，从转色期开始，无论PSY1还是PSY2基因的表达量均明显低于常温对照，且整个成熟过程中表达水平均较低。值得注意的是，从转色期到坚熟期为番茄红素在果实中迅速积累的关键时期，PSY1与PSY2的表达量均显著低于常温对照。

常温下，PDS相对表达量逐渐增加，完熟期达到最高，与番茄红素含量变化一致。低温下，PDS相对表达量先降低后升高，总体呈降低趋势，青熟期PDS表达量最高。常温和低温条件下ZDS的相对表达量都是先降低后升高，总体呈升高趋势;常温和低温条件下的ZDS相对表达量差别不大，常温下略高。但值得注意的是在低温下，从半熟期到坚熟期，PDS与ZDS呈明显下调趋势，特别是在坚熟期，它们的表达量显著低于常温对照。

图3 番茄果实各成熟期的PSY1、PSY2、PDS

和ZDS的相对表达情况

3 讨 论

通过上述分析表明，正常条件下，番茄果实在转色期开始迅速积累番茄红素，而半熟期到坚熟期番茄红素积累速率最快，到坚熟期番茄红素含量基本稳定。低温条件下，番茄果实番茄红素积累速率明显受到抑制，从转色期到完熟期果实番茄红素含量积累严重不足，导致番茄果实不能转红。

PSY基因是类胡萝卜素代谢途径中第一个限速酶基因。本研究结果显示PSY1与PSY2在低温条件表达水平明确受抑制，这可能会导致番茄红素合成的前体物质八氢番茄红素（phytoene）严重不足;同时在番茄果实积累番茄红素的关键时期（半熟期到坚熟期），PDS和ZDS的相对表达水平也受低温抑制，导致番茄红素合成受阻。因此，低温条件下，番茄红素合成的前体物质八氢番茄红素合成不足，同时番茄红素合成相关酶基因PDS和ZDS表达受抑制，因此番茄红素合成和积累水平降低是番茄转色困难的重要原因。

参考文献

[1]    徐鹤林，李景富. 中国番茄[M]. 北京：中国农业出版社，2007.

[2]    邹礼平，高和平，钟亚琴. 植物番茄红素生物合成相关基因的表达调控研究进展[J]. 安徽农业科学，2009，37（33）：16232-16233，16242.

[3]    Wurbs D，Ruf S，Bock R. Contained metabolic engineering in tomatoes by expression of carotenoid biosynthesis genes from the plastid genome[J]. Plant Journal，2007，49（2）： 276-288

[4]    赵文恩，李艳杰，崔艳红，等. 类胡萝卜素生物合成途径及其控制与遗传操作[J]. 西北植物学报，2004，24（5）： 930-942.

[5]    Steven K，Clinton M D. Lycopene：Chemistry，biology，and implications for human health and disease[J]. Nutrition Reviews，1998，56（2）： 35-51.

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[7]   Robertson G，Mahoney N. Reglation of lycopene formation in cell suspension culture of VENT tomato by CPTA， growth regulation，sucrose，and temperature[J]. Journal of Experimental Botany，1995，46： 667-671.