大叶杨组培快繁体系的建立

彭言劼　李明勇　赵亚津　庞旭凤　宋春草　熊瑞婷　杜克兵

摘 要： 以大叶杨幼嫩的带腋芽茎段为试材，建立以腋芽诱导途径为基础的植株组培快繁体系。结果表明：大叶杨腋芽诱导的最适宜培养基为MS+NAA0.1 mg/L+6BA0.1 mg/L，接种30 d，腋芽萌发率可达100%；最适宜增殖培养基为MS+NAA0.1 mg/L+6BA2.0 mg/L，培养30 d，增殖系数可达4.0，幼苗生长健壮；最佳生根培养基为1/2MS+NAA0.1 mg/L+IBA0.2 mg/L，培养30 d，平均生根达4条，平均根长为4.7 cm。

关键词： 大叶杨；组织培养；腋芽诱导；快繁体系

中图分类号：S722.3+7；Q813.1+2 文献标识码：A 文章编号：1004-3020（2015）02-0013-04

大叶杨Populus lasiocarpa 属于杨柳科Salicacae杨属大叶杨派Leucoides的一种植物，是杨属植物中最古老最原始的树种之一，为中国特有的乡土树种，原产于华中地区，仅在湖北、陕西、四川、贵州和云南省有野生种分布，国外无野生种群分布[1-2]。大叶杨适宜海拔600～2 800 m的山地，具有较高的生态价值，其高山地区的适生性是山地杨树育种的优良基因资源。但是，迄今大叶杨仍处于野生状态，未得到有效保护与利用。因此，开展大叶杨种质资源的保存与利用研究具有重要意义。

已有研究显示，大叶杨扦插成活率极低，不同生根剂处理的枝插成活率均为零，根插成活率亦低于15%。嫁接成活率相对较高，但对砧木要求特殊，目前仅发现山地杨与其具有较高的亲和性[3]。这些都对大叶杨种质资源的保存造成一定困难。组织培养是快速高效繁殖、保存种质资源的重要方法。然而，目前大叶杨尚无这方面的报道。本研究以湖北省大叶杨优良单株为试材，开展组织培养研究，建立高效组培快繁体系，以期为我国大叶杨优良种质资源的保存和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

从湖北省宜昌市樟村坪林场，东经111°4′～111°13′，北纬31°11′～31°18′，平均海拔1 100 m选择大叶杨优良单株，截取健壮的休眠枝条，带回实验室水培催芽。

1.2 无菌材料的获得

将带腋芽的茎段置于饱和的洗衣粉溶液中浸泡10 min，取出洗净后用流水冲洗1.5 h，并用蒸馏水润洗3遍，再于超净工作台中消毒。消毒方法为：先用70%的酒精浸泡30 s，随后用无菌蒸馏水冲洗2遍，再用0.1%升汞溶液浸泡5 min（期间不断晃动），接着用无菌蒸馏水冲洗6次，所获得的材料即为无菌的外植体。将带腋芽的茎段切成长1.5 cm左右的小段（带1个腋芽），接种于腋芽诱导培养基中，进行腋芽诱导培养。

1.3 腋芽诱导

基本培养基选择杨树组织培养中最常用的MS培养基（pH=5.8）[4]，选用6BA 4个浓度水平（0.1，0.5，1.0，2.0 mg/L）和NAA 2个浓度水平（0.1，0.5 mg/L），以及不含任何激素的MS培养基，共设计9种处理（表1），每处理4次重复，每重复接种4个外植体。在对黑杨派杨树组培的研究中发现，虽然BA与NAA的比值高有利于芽的诱导，但无NAA的培养基诱芽效果不及含有少量NAA的培养基[5]，故本试验中均不设单一激素处理。培养条件为光照强度为1 500～2 000 lx，温度（25±2）℃，光照时间16 h/d。接种10 d后统计污染率与褐化率，30 d后统计腋芽萌发率。其中，污染率（%）=污染的茎段数/接种的总茎段数×100%；褐化率（%）=褐化的茎段数/接种的总茎段数×100%；腋芽萌发率（%）=腋芽萌发的茎段数/接种的茎段数×100%。

1.4 增殖培养

将诱导萌发的腋芽切下，接种于增殖培养基中进行增殖培养。以MS作为基本培养基，选用6BA 3个浓度水平（0.5，1.0，2.0 mg/L）和NAA 3个浓度水平（0.05，0.1，0.25 mg/L），共9个处理（表2），采用完全随机试验设计，每处理5次重复，每重复接种3～4个腋芽，30 d后统计增殖系数及生长情况。其中，增殖系数=30 d有效芽数/接种芽数。

1.5 生根培养

将增殖培养后高约2.0 cm的幼苗切下，接种于生根培养基中进行生根培养。采用1/2MS培养基为基本培养基，激素选用NAA 2个浓度水平（0.1，0.2 mg/L）和IBA 3个浓度水平（0.1，0.2，0.4 mg/L），共6种处理（表3），每处理3次重复，每重复接种4棵苗。30 d后统计生根数量及根长。

1.6 数据分析

试验中的所有数据采用Excel2003软件进行处理，用SAS9.0进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对大叶杨腋芽诱导的影响

接种10 d后，腋芽诱导培养的茎段污染率为3.81%，褐化率为3.47%。外植体接种后，约7 d腋芽明显膨大，12 d后腋芽开始萌发，部分外植体基部膨大形成黄绿色愈伤组织（图1A）。30 d 时统计结果显示，外植体腋芽萌发率最低的培养基为IC1，仅为31.3%。6种培养基（IC2～IC4、IC6、IC8、IC9）的腋芽诱导率达到了75%以上，且相互之间差异不显著（P>0.05）。其中，IC2的腋芽萌发率最高，达到100%，且茎段生长正常，叶片鲜绿（表1，图1A）。方差分析显示，6BA及其与NAA的交互作用对腋芽诱导的影响达到极显著水平（P<0.01），而NAA的影响不显著（P>0.05）。随着6BA浓度的升高，萌发的腋芽茎段几乎不伸长，呈丛生状。综合萌发率与腋芽生长性状，选择IC2（NAA 0.1 mg/L + 6BA 0.1 mg/L）为大叶杨腋芽诱导的最适培养基。

2.2 增殖培养

增殖培养过程中，幼苗在叶柄处产生腋芽，同时在基部切口处分化出不定芽（图1B），或者基部膨大形成愈伤组织，再从愈伤组织分化不定芽（图1C）。9种培养基对增殖效果的影响极显著（P<0.01）。方差分析显示，NAA、6BA对增殖效果的影响皆达到极显著水平（P<0.01），两者的的交互作用对增殖效果的影响也达到显著水平（P<0.05）。在NAA浓度不变的情况下，随着6BA浓度的增加，增殖系数呈上升趋势。6BA/NAA浓度的比值在20以上的3种培养基（PM2，PM3，PM6）的增殖系数显著高于其他组合（P<0.05）。两者的比值达到40时（PM3），导致幼芽长势弱，节间生长不明显，芽成簇状芽。9种培养基中，PM6的增殖系数最高，达到4.0，且芽苗生长健壮（图1C），故认为PM6（NAA 0.1 mg/L + 6BA2.0 mg/L）为大叶杨的最适增殖培养基。

2.3 生根培养

培养7 d后，幼苗逐渐从基部生出不定根，30 d时6种培养基中，幼苗生根率皆为100%（表3）（图1D）。当IBA浓度相同时，0.1mg/L的NAA（R1，R3，R5）对生根的促进作用显著大于0.2 mg/L的NAA（P<0.05）。生根效果最好的是R3和R5，两者间差异不显著（P>0.05）。R5的生根条数最多（4.7根），平均根长也最长（5.27 cm）（表3），但基部膨大形成愈伤组织，炼苗时易造成根系折断。R3的生根条数为4条，平均长度为4.7 cm（表3），且根系分支发达（图1D），幼苗生长健壮。因此，选择R3（NAA0.1 mg/L+IBA0.2 mg/L）培养基为大叶杨最适生根培养基。

3 讨论

利用组织培养进行种质资源离体保存，不仅能在短时间内获得大量的无性系，而且有占据空间小，节约土地资源和降低保存成本等优势[6]。目前，已有许多物种利用组培进行种质资源离体保存的报道，例如葡萄[7]、柑桔[8]等，也有大量杨树组织培养快繁的报道，如箭杆杨[6]、钻天杨[9]、山新杨[10]等。本研究以大叶杨腋芽诱导途径建立了较高效的组培快繁体系，实现了大叶杨利用组培方法进行种质资源的离体保存。

NAA已被报道普遍使用于杨树及其他植物的组织培养中，对培养结果影响显著，而大叶杨腋芽诱导的方差分析结果表明，NAA对诱芽效果的影响不显著（p>0.05），试分析原因可能是本研究中NAA浓度取值范围太小，NAA的诱芽效果在此范围内差异不显著，亦可能是大叶杨对NAA不敏感。后者与全永寿等[3]用不同生根剂处理大叶杨枝条进行扦插无成活的情况相符。

除了激素的种类和浓度对植物产生的影响外，激素间的不同配比对组培效果的影响也很重要。于志水等[5]在黑杨派杨树的组培体系研究中发现，6BA和NAA的比值对芽诱导具有调控作用，比值越大越有利于芽诱导。本研究增殖培养中观察到的相似的情况。高比值（20以上）的组合对芽的诱导有明显的促进作用，在比值相同，激素浓度不同时也有相似的效果（PM2与PM6）（表2）。但是，过高浓度的6BA（PM3）会造成芽苗长势弱，基部叶片大，节间生长不明显，形成簇状芽。这种丛生芽不仅在继代操作中不易切割开，而且在后来的培养中易畸形或玻璃化[11，12]。

生根是组织培养中的一个关键环节，生根是否成功可以决定能否得到一棵完整的植株。而大叶杨扦插繁殖几乎不能成活，原因可能是不易生根。本研究采用了两个促进生根的措施解决了这个问题，一是使用无机元素减半的1/2MS作为基本培养基促进侧根的发育[13]；二是采用IBA与NAA两种促进生根的激素组合。付成华[14]在对常绿杨生根培养时发现，过高浓度的IBA会使根系纤细，毛状根少，基部产生膨大的愈伤。本研究中在IBA浓度达到0.4 mg/L（R5）时，植株基部膨大，根系细，分支少，而在0.2 mg/L的IBA（R3）中生长的植株根系粗壮，分支发达（图1D）。

参 考 文 献

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（责任编辑：郑京津）