石斑鱼遗传多样性及其系统发育分析

李庆等

摘要石斑鱼不仅是重要的海水经济鱼类，而且具有重要的生态地位。但是，石斑鱼的分类、物种多样性、资源保护及其合理开发等需要对石斑鱼系统发育的分析与研究。线粒体基因是研究石斑鱼系统进化的理想分子标记，因此获得了青石斑鱼E.awoara长度为1 039 bp 的16S rDNA、tRNA-Leu和NA1部分序列，基于其及ND2、cyt b对石斑鱼系统发育进行了分析，结果表明石斑鱼遗传多样性与地域分布关系不大，不同系统树分析都表明同一石斑鱼物种的系统发生关系基本一致，石斑鱼种间亲缘关系较近。此外，也发现某些异种间亲缘关系比同种间亲缘关系近的现象。

关键词石斑鱼；遗传多样性；系统发育

中图分类号S965.44；Q17文献标识码

A文章编号0517-6611（2015）29-075-05

石斑鱼是石斑鱼属（Epinephelus）鱼类的统称，隶属鲈形目（Perciformes）、鮨科（Serranidae）、石斑鱼亚科（Epinephelinae），其种类多，分布广。我国有石斑鱼种类46种，主要分布在南海和东海南部。石斑鱼是重要的世界性海洋经济鱼类之一，在海洋生态中占有重要地位，也是重要的海水增养殖对象。但是，海洋环境污染、过度捕捞、养殖群体的近亲繁殖等已使鱼类资源不断衰退，部分種类已被列为濒危物种。在我国科技兴海战略中，石斑鱼的合理开发和资源保护已迫在眉睫。

石斑鱼为定居性鱼类，形态保守，石斑鱼的分类多以体形、条纹、体色、斑点、骨骼等性状为主要依据。但是不同生境、应激状态及不同发育阶段下，很多石斑鱼种类的体色和斑纹常会发生明显变异，石斑鱼种类鉴定困难，有时会造成种类鉴定上的失误，增加了系统发生关系研究的难度。此外，石斑鱼中还存在同名异种及同种异名的现象，甚至在生态系统破坏压力之下，石斑鱼亲缘关系相近的种类可能也存在杂交现象。因此，这给物种多样性研究、渔业资料保护和合理利用及石斑鱼育种养殖带来一定的困难，也给养殖生产中亲本和鱼种的引进和鉴定带来了一定的困难。然而，随着分子生物学的发展，分子系统学方法的应用为石斑鱼传统分类提供了重要佐证和补充修正。

动物线粒体DNA具有序列简单和进化速度快等特点，在鱼类分子系统学研究中得到广泛应用。对石斑鱼线粒体DNA的分析表明，线粒体基因，尤其是16S rDNA、cyt b和ND2基因是对石斑鱼属内种间系统进化分析进行评估的理想分子标记[5-7]。笔者获得了青石斑鱼（E.awoara）的16S rDNAtRNALeuDA1序列（16S rDNA、tRNALeu和部分DA1序列），分析石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1的遗传多样性，比较青石斑鱼（E.awoara）分子系统发育关系与传统分类的异同，并基于目前GenBank数据库中已知石斑鱼cyt b和ND2基因完整序列分析石斑鱼的系统发生关系及空间距离对石斑鱼遗传多样性的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验用石斑鱼。青石斑鱼（E.awoara）购自湛江某石斑鱼养殖场，活体运回实验室后，取肌肉组织放入-80 ℃超低温冰箱中备用。试验所用其他石斑鱼相关信息及基因序列来源于GenBank数据库。

1.1.2菌株与载体。大肠杆菌DH5α菌株由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室保存，pMD18T载体pEGFPN3载体购自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1基因组DNA的提取。取青石斑鱼（E.awoara）肌肉组织约50 mg，采用传统的酚-氯仿抽提方法进行基因组DNA提取。

1.2.2青石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1的克隆。

根据GenBank数据库上的同源序列设计并扩增青石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1基因的引物为16SF （5′GGCTGTGGAGTCAACCAG–3′）和16SR （5′GGCTTHAGRTCTCTGTG3′）。

PCR反应体系（25 μl）为：ddH2O 15.5 μl、DNA（约30 ng）2 μl、引物（10 μmol/L） 1 μl、dNTPs （2.5 mmol/L） 2 μl、10×ExTaq Buffer 2.5 μl、ExTaq酶 （1 U/μl） 0.125 μl。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min ；95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 2.5 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳产物纯化回收后与pMD18T载体连接，转化至大肠杆菌 DH5α菌株，筛选阳性克隆并送至上海生工生物有限公司测序鉴定。

1.2.3石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1、cyt b和ND2遗传多样性及石斑鱼系统发育分析。

应用DNAstar软件（Lasergene）并结合人工调整，对石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1、cyt b和ND2序列分别进行排列；应用MEGA软件分析变异位点、信息位点和遗传距离。

应用ModelTest分别模拟石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1、cyt b和ND2进化模式，并将不同的模拟结果作为参考值构建系统树。基于16S rDNAtRNALeuDA1、cyt b和ND2分别用MEGA软件构建最大简约树（MP）、最大似然树（ML）、最小进化树（ME）、非加权组平均树（UPGMA）和邻接树（NJ）。分别用MrBayes软件进行Bayesian分析，并采用genera1timereversible+gamma+invariants（GTR+G+I）序列进化模型和Markov Chain Monte Carlo（McMc）取样方式估计系统发生关系。MrBayes分析参数为：nst=6，rates=gamma，进行100 000 次重复检验后，获得系统树的支系结构和各支的置信度。后验概率和系统树枝长计算参数为：bumin=500，contype=allcompat。分别用PAUP软件进行运算，Heuristic搜索采用二分支方式构建系统树支系（TBR branch swapping），并加入随机序列重复抽样；系统树各支的置信度，通过Bootstrap[12]重复抽样1 000次后获得。同时，基于CYTB和ND2蛋白序列构建系统树。

2结果与分析

2.1青石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1的克隆

从图1可以看出，经PCR扩增、克隆和测序，获得青石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1序列，长度为1 039 bp（GenBank编码：KR703819），经Blast检索其与青石斑鱼E.awoara 相应基因（JX109835）的相似率为97.7%。

2.2石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1遗传多样性及基于其石斑鱼系统发育分析

分析27尾鱼的16S rDNAtRNALeuDA1序列含有308个变异位点和160简约信息位点。对石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1序列分析发现，采集于同一地域的分离株16S rDNAtRNALeuDA1的同源率为100%，如采集于我国的赤点石斑鱼E.akaara（EU043377、KJ700440、KM458971和NC011113）、宝石石斑鱼E.areolatus（KC466080、KC593374和NC020785）、青石斑鱼E.awoare（JX109835和NC018773）、橙点石斑鱼E.bleekeri（KF556648和NC022848）、斜带石斑鱼E.coioides（NC011111、EU043376和KM377093）、小纹石斑鱼E.epistictus（KC816460和NC021462）、拟青石斑鱼E.fasciatomaculosus（KC480085和NC020782）、褐点石斑鱼E.fuscoguttatus（JX119192和NC020046）、鞍带石斑鱼E.lanceolatus（FJ4723837和NC011715）、宽带石斑鱼E.latifasciatus（KC480177和NC020784）、云纹石斑鱼E.moara（JQ518290、KP009977和NC017891）、玳瑁石斑鱼E.quoyanus（KC790539和NC021450）、六带石斑鱼E.sexfasciatus（KC959953和NC021765）、南海石斑鱼E.stictus（KC527593和NC021133）、三斑石斑鱼E.trimaculatus（KC847086和NC021612）与黑斑石斑鱼E.tukula（KJ414470和NC024039），采集于韩国的褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964和NC013820）与七带石斑鱼E.septemfasciatus（FJ594966和NC013829）以及采集于日本的蜂巢石斑鱼E.merra（AP005991和NC022509）。将GenBank数据库中非相同的石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1序列进行比对，计算两两序列间的相似度和遗传距离（表1），并构建系统树（图2）。

基于石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1序列所构建系统树的拓扑结构基本一致，石斑鱼分为两大分支，石斑鱼两两间的遗传距离普遍较小；从遗传距离和系统树分析来看，该试验所用石斑鱼确定为青石斑鱼（E.awoara），与传统方法分类相一致；采集于不同地域的同一种石斑鱼多聚在一起，如采集于中国和韩国的赤点石斑鱼E.akaara（EU043377/China和KJ700439/Korea）以及采集于中国和马来西亚的鞍带石斑鱼E.lanceolatus（FJ472837/China、KM386619/China、KJ451389/ China和HQ660062/Malaysia）；但采集于韩国和中国的褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964/Korea和JQ51828/China）没有聚在一起，褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964/Korea）却与云纹石斑鱼E.moara（JQ518289/China）聚在一起。采集于韩国和中国的褐石斑鱼E.bruneus FJ594964/Korea和JQ51828/China间的遗传距离为0.013，而褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964/Korea）与云纹石斑鱼E.moara（JQ518289/China）的遗传距离仅为0.001。呈现出的矛盾是褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964/Korea）与云纹石斑鱼E.moara（JQ518289/China）的亲缘关系比褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964/Korea和JQ51828/China）二者间的亲缘关系更近，因此将基于石斑鱼cyt b和ND2基因序列进一步分析石斑鱼间的系统发生关系。

2.3石斑鱼ND2基因遗传多样性分析及基于ND2基因石斑鱼系统发育分析

分析中ND2基因序列含有641个变异位点和413个简约信息位点。石斑鱼ND2基因序列分析结果与16S rDNAtRNALeuDA1分析结果基本一致，采集于同一地域的分离株ND2的同源率多为100%，如采集于中国的赤点石斑鱼E.akaara（EU043377和NC011113）、宝石石斑鱼E.areolatus（KC466080和NC020785）、青石斑鱼E.awoare（JX109835和NC018773）、布氏石斑鱼E.bleekeri（KF556648和NC022848）、斜帶石斑鱼E.coioides（NC011111、EU043376和KM377093）、小纹石斑鱼E.epistictus（KC816460和NC021462）、拟青石斑鱼E.fasciatomaculosus（KC480085和NC020782）、褐点石斑鱼E.fuscoguttatus（JX119192和NC020046）、鞍带石斑鱼E.lanceolatus（FJ4723837和NC011715）、宽带石斑鱼E.latifasciatus（KC480177和NC020784）、云纹石斑鱼E.moara（JQ518290、KP009977和NC017891）、玳瑁石斑鱼E.quoyanus（KC790539和NC021450）、六带石斑鱼E.sexfasciatus（KC959953和NC021765）、南海石斑鱼E.stictus（KC527593和NC021133）、三斑石斑鱼E.trimaculatus（KC847086和NC021612）与蓝身大斑石斑鱼E.tukula（KJ414470和NC024039），采集于韩国的褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964和NC013820）与七带石斑鱼E.septemfasciatus（FJ594966和NC013829）以及采集于日本的蜂巢石斑鱼E.merra（AP005991和NC022509）。

基于石斑鱼ND2基因序列和ND2蛋白序列构建系统树的拓扑结构基本一致，石斑鱼分为两大分支，石斑鱼两两间的遗传距离普遍较小；同一种石斑鱼多聚在一起，与不同地域的关系并不大，如采集于中国和韩国的赤点石斑鱼E.akaara（EU043377/China、KJ700440、KM458971和KJ700439/Korea）及采集于中国和马来西亚的鞍带石斑鱼E.lanceolatus（FJ472837/China、KM386619/China、KJ451389/China和HQ660062/Malaysia）；但是，采集于韩国和中国的褐石斑鱼E.bruneus FJ594964/Korea和JQ51828/China没有聚在一起，褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964/Korea）却与云纹石斑鱼E.moara（JQ518289/China）聚在一起。采集于韩国和中国的褐石斑鱼E.bruneus FJ594964/Korea和JQ51828/China二者间的遗传距离为0.052，而褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964/Korea）与云纹石斑鱼E.moara（JQ518289/China）的遗传距离仅为0.001。这再次表现出与基于16S rDNAtRNALeuDA1分析相同的矛盾，即褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964/Korea）与云纹石斑鱼E.moara（JQ518289/China）的亲缘关系比褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964/Korea和JQ51828/China）二者间的亲缘关系更近（图3）。

2.4石斑鱼cyt b基因的遗传多样性分析及基于cyt b基因石斑鱼系统发育分析

已知石斑鱼cyt b基因序列较多，140尾横带石斑鱼（E.fasciatus）不同个体cyt b基因序列间相似度为95.4%～99.9%，24尾褐点石斑鱼（E.fuscoguttatus）不同个体cyt b基因间的相似度为97.5%～99.9%。

基于石斑鱼cyt b基因序列和CYTB蛋白序列构建系统树的拓扑结构基本一致，石斑鱼分为两大分支，此系统树覆盖石斑鱼种类较多，系统发育关系比较复杂。

从系统发育树来看，褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964和JQ518289）、云纹石斑鱼E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）与布氏石斑鱼E.bleekeri（AY963558）聚为一小分支，而布氏石斑鱼E.bleekeri（KF556648）与鲑点石斑鱼E.fario（DQ372726和DQ486931）又聚为另一小分支，且此2个小分支相距较远。从遗传距离和相似率来看，2尾布氏石斑鱼E.bleekeri（AY963558和KF556648）间的遗传距离和相似

率分别为0.151和86.1%，而其与云纹石斑鱼E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）间的遗传距离分别和相似率分别为0.001、0.002和95.8%、95.9%或0.160、0.161和85.1%、85.2%，与鲑点石斑鱼E.fario（DQ372726和DQ486931）间遗传距离和相似率分别为0.151、0.153和

85.9%、86.1%和相似率分别或0.007、0.009和99.1%、99.3%。褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964和JQ518289）与云纹石斑鱼E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）的遗传距离和相似率分别为0.001、0.002和99.8%、99.9%或 0.043、0.044和95.8%、95.9%），而两尾褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964和JQ518289）间的遗传距离和相似率分别为 0.043和95.9%，三尾云纹石斑鱼E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）间的遗传距离和相似率分别为0.002、0.003和99.7%、99.8%。这再次呈现出与上述相似的矛盾，即布氏石斑鱼E.bleekeri（AY963558）与云纹石斑鱼E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）或布氏石斑鱼E.bleekeri（AY963558）与鲑点石斑鱼E.fario（DQ486931）的亲缘关系比两尾布氏石斑鱼E.bleekeri（AY963558和KF556648）的亲缘关系还要近；褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964和JQ518289）与云纹石斑鱼E.moara（JQ518290、AY786427）的亲缘关系比两尾褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964和JQ518289）的亲缘关系要近，褐石斑鱼E.bruneus（FJ594964和JQ518289）与云纹石斑鱼E.moara（JQ518290、AY786427）的亲缘关系类似于三尾云纹石斑鱼E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）简的亲缘关系（图4）。

3讨论

笔者对石斑鱼进行分子系统学研究，为石斑鱼传统分类提供了重要佐证和补充修正，在一定程度上减少物种鉴定的误差。该研究所用石斑鱼为青石斑鱼（E.awoara）与传统分类学鉴定结果相同。此外，该研究基于石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1、ND2和cyt b对石斑鱼系统发生關系和遗传距离的分析发现，石斑鱼遗传多样性与地域分布关系不大。从系统发育树来看，基于石斑鱼16S rDNAtRNALeuDA1、ND2基因构建的系统树两大分支物种相同，而基于石斑鱼cyt b基因构建的系统树石斑鱼两大支物种则有所不同，可能与此系统树所含石斑鱼物种比上述系统树所含石斑鱼物种较多有关，但此3个系统树中相同物种石斑鱼系统发生关系基本一致。同时，也再次证实了石斑鱼线粒1体16S rDNA、ND2和cyt b基因可用于石斑鱼分子系统学研究分析，目前已知石斑鱼的cyt b基因最多，相关信息也较多，由此认为cyt b基因是研究石斑鱼分子系统学的优先选择标记。

石斑鱼分子系统学分析为相关科研和养殖应用带来了很大帮助，笔者在该研究中不仅发现石斑鱼种间亲缘关系非常近，但也发现一些其他问题，如有的褐石斑鱼E.bruneus与云纹石斑鱼E.moara的亲缘关系比褐石斑鱼间的亲缘关系还近，与云纹石斑鱼E.moara间的亲缘关系相似；有的布氏石斑鱼E.bleekeri与云纹石斑鱼E.moara或与鲑点石斑鱼E.fario的亲缘关系比布氏石斑鱼E.bleekeri间的亲缘关系还要近。这些问题的解决有待深入研究。同时，这些问题的呈现也说明了在石斑鱼物种多样性、渔业资料保护和合理利用及石斑鱼育种养殖等方面的困难和不便，同时也体现了生态系统破坏给石斑鱼生存带来的压力。研究表明，盐度对斜带石斑鱼E.coioides生长、生理及抗病能力有显著影响，盐度渐变和骤变对褐点石斑鱼E.fuscoguttatus存活和摄食也有影响[14]。

为彻底解决目前石斑鱼面临的问题，应保护石斑鱼的物种多样性、保护生态环境，深入研究石斑鱼分类学和分子系统学，及时更正、修正已出现的失误等。石斑鱼种质资源问题不容忽视，如斜带石斑鱼E.coioides已被国际自然资源保护联盟列入近危种[15]。

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