滇龙胆甲羟戊酸激酶基因的克隆与表达分析

张晓东 李彩霞 赵静 杨娇 王元忠

摘 要：甲羟戊酸激酶是甲羟戊酸途径的关键酶。根据滇龙胆转录组甲羟戊酸激酶基因GrMK序列，设计一对基因特异性引物克隆该基因，并进行序列分析；构建原核表达栽体pGEX-4T-l-GrMK，转入大肠杆菌Rosetta（DE3），重组蛋白在37 0C、1.0 mmoVL IPTG诱导下成功表达。生物信息学分析结果表明，GrMK蛋白为甲羟戊酸激酶家族成员，具有MK蛋白保守结构域：乳糖激酶/高丝氨酸激酶/甲羟戊酸激酶/磷酸甲羟戊酸激酶（GHMPkinase）N端结构域、C端结构域和ATP结合结构域；GrMK与长春花CrMK亲缘关系最近，原核表达结果表明，融合蛋白相对分子质量与推断大小一致。组织特异性表达分析结果表明Gr MK基因主要在根中表达.这些结果为GrMK蛋白结构和功能的研究奠定基础。

关键词：滇龙胆：甲羟戊酸激酶；基因克隆；表达分析

中图分类号：Q786

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2015）03-0196-07

滇龙胆Gentiana rigescens Frach. Ex Hemsl.是传统中药龙胆品种之一，是滇产重要道地药材。滇龙胆也是常用大宗药材，是龙胆泻肝片、小儿清热片和苦胆草片等200多种中成药的主要成分[1]。近年来，国内外市场对龙胆的需求量在3 000—4 000吨左右，并且医疗用龙胆需求量每年递增10%左右，市场缺口很大，导致野生滇龙胆资源遭到毁灭性的破坏[1]。滇龙胆的主要药效成分为龙胆苦苷，要从根本上解决滇龙胆的药源问题，必须弄清龙胆苦苷生物合成途径及其调控机制[2]，为龙胆苦苷的异源生物合成奠定基础。

龙胆苦苷属于裂环烯醚单萜，在植物中单萜一般是通过胞质甲羟戊酸（MVA）途径和质体2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径合成的[3]在长春花MVA途径中，甲羟戊酸激酶（mevalonatekinase，MK，EC 2.7.1.36）能够催化ATP中γ磷酸基团转移到甲羟戊酸C5羟基上，导致甲羟戊酸5-磷酸和ADP的生成[4]，该酶活性取决于二价阳离子Mg2+或Mn2+，其适宜pH为7～10，最适pH为8.9[5]。该酶被认为是萜类生物合成的调控酶[6]。在植物中，甲羟戊酸激酶受下游代谢物反馈抑制，法尼基焦磷酸（ FPP）、异戊烯基焦磷酸（IPP）、DMAPP（二甲烯丙基焦磷酸）和栊牛儿基焦磷酸（ GPP），甚至植基二磷酸（PDP），均能抑制MK蛋白活性I 7|。目前，甲羟戊酸激酶基因MK已从拟南芥[6]、长春花[8]、丹参[9]、秦艽[10]、三七[11]、杜仲[12]、林烟草[13]等许多植物中分离。Zhuang等将甲烷八叠球菌基因Mm，MyK在大肠杆菌中表达，纯化后结晶，并使用X射线衍射技术对晶体结构进行了初步分析[14]。MK基因的表达具有组织特异性，并被生物和非生物因素诱导。在拟南芥中，AtMK基因主要在根和花中表达；启动子缺失实验结果表明AtMK基因上游-295至-194区域对于该基因的高表达至关重要[6]。在杜仲中，EuMK3基因启动子中存在大量的光诱导元件和植物激素诱导元件，因此其转录活性可能受光和植物激素的调控[12]。在生物诱导剂（100 mg/mL酵母提取物）和非生物诱导剂（ 30 mmol/L Ag+）共同诱导下，丹参SmMK基因在诱导后12 h表达量达到最高[15]。在乳酸链球菌中，共表达MVK和HMGR基因能够使倍半菲兰烯（倍半水芹烯）产量加倍[16]。

目前，为选育高产、优质和高抗的龙胆草，云南省已启动长达7年的龙胆草航天育种工程[17]。但是，由于龙胆基因组资源极度匮乏[18]导致其分子生物学研究进展缓慢。前期作者实验室分别对滇龙胆的根和叶进行转录组测序，本研究基于转录组数据库中Gr MK基因序列，通过RT-PCR技术成功地从滇龙胆幼叶中扩增到GrMK基因，并进行序列分析、原核表达和组织表达特异性分析，以期为滇龙胆主要药效成分的生物合成及其调控机理的解析提供帮助。

1 材料与方法

1.1植物材料

滇龙胆采自玉溪师范学院分子生物学实验室的组培苗和盆栽苗，由云南省农业科学院药用植物研究所金航研究员鉴定为滇龙胆Centiana rigescens Frach.Ex Hemsl.。基因克隆所用材料为滇龙胆无菌苗幼叶，基因表达分析使用材料为盆栽3年生滇龙胆的根、茎和叶，采样日期为2014年5月17日。

1.2方法

1.2.1 叶片总RNA提取及GrMK基因克隆

按照植物多糖组织提取试剂盒（Takara，大连）说明书提取滇龙胆幼叶总RNA，按照反转录试剂盒（Takara，大连）说明书合成cDNA。根据原核表达载体pGEX-4T-l多克隆酶切位点和转录组中滇龙胆GrMK基因序列，设计一对特异引物GrMKBamH I-F和GrMKXho I-R（表1）。采用Tran，sTaq DNA Polymerase High Fidelity（2.5 U/μL，Transgene，北京）酶进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94 °C变性30 s，55℃退火30 s，72 °C延伸1 min 10 s，30循环；72 °C延伸7 min。PCR产物经1.O%琼脂糖凝胶电泳分离，割胶后使用胶回收试剂盒（Qiagen，德国）对目的片段进行回收，将其连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（Takara，大连），涂布于含100 mg/L氨苄青霉素（Takara，大连）+IPTG（Takara，大连）+X-Gal（Takara，大连）的LB固体平板上，37 0C培养13 h后挑取12个白斑，37 0C、250 r/min摇床培养12 h后提取12管质粒，从大小正确的质粒中选取3个，经单双酶切鉴定正确后进行测序，获得重组质粒pMD19-Gr MK。1.2.2 GrMK基因原核表达载体构建及原核表达

分别对质粒pGEX-4T-l（实验室保存）和pMD19-GrMK进行双酶切、连接，获得原核表达载体pGEX-4T-l-GrMK。使用热激法将重组质粒pGEX-4T—l—GrMK转化大肠杆菌Rosetta（ DE3）感受态细胞（Transgene，北京）后，挑取单菌落接种于3 m_L含100 mg/L氨苄青霉素LB液体培养基中，37 0C、250 r/min培养12 h。然后以1：100比例转接到无抗生素的LB液体培养基中，37 0C、250 r/min培养3h至A600≈0.8，在37 °C、终浓度为1 mmol/L IPTG诱导下进行表达，同时以相同条件的pGEX-4T-l转化菌作为对照。分别诱导Oh、2h、4h和6h后收集菌液2 mL。4 °C、8 000 r/min离心1 min，弃上清，加入100 yLddH20、25 yL的5xSDS-PAGE上样缓冲液，震荡悬菌，沸水煮5 min。4 °C、13 000 r/min离心5min。取20μL上清上样，进行SDS-PAGE（5 %浓缩胶和10%分离胶）电泳检测。

1.2.3 Gr MK基因的生物信息学分析

使用NCBI网站上的BLAST程序进行序列比对，应用Genetyx进行翻译，使用DNAMAN 7进行多序列比对；用Clustal X2.1进行比对，然后使用MEGA6.0软件内置的NJ法构建系统进化树，设置Bootstrap=1 000；利用在线数据库（http：//molbiol. edu.ru/eng/scripts/Ol_ll.html）进行稀有密码子分析。使用ChloroP服务器vl.l进行叶绿体转运肽预测；使用Interpro软件进行保守结构域预测；使用ProtScalee软件进行疏水性分析；使用PredictProtein对二级结构进行预测；使用Swiss-Model Workspace自动模式对三级结构进行预测；利用Expasy中的TMHMM工具预测蛋白的跨膜螺旋区；利用在线工具WOLF PSORT预测蛋白的亚细胞定位情况。

1.2.4 GrMK基因的实时定量分析

分别取3年生滇龙胆的根、茎和叶，提取总RNA，使用DNase I处理除去基因组DNA。使用反转录试剂盒（Takara，大连）合成第一链cDNA。以转录组中Gr GA PDH基因（GenBank登录号KM061807）作为内参设计引物GrGAPDH—F和GrGAPDH-R（表1），PCR反应条件为：95 0C 3 min，95 0C 15 s，60 0C 31 s。根据GrMK基因的ORF序列设计特异性引物GrMK-F和GrMK-R（表1）。使用SuperReal PreMix Plus试剂盒（天根，北京）进行qPCR，PCR反应条件为：95 0C 3 min，95 0C15 s，60 0C 31 s。每个反应重复3次。反应在ABI7000荧光定量PCR仪（Applied Biosystems，USA）上进行扩增，扩增曲线、溶解曲线、标准曲线由定量PCR仪软件自动生成。使用内参基因Gr GA PDH表达校准后，计算根茎叶中GrMK基因相对表达量。采用比较Ct值的“2-Ana'的方法进行定量数据的分析处理。

2结果与分析

2.1滇龙胆GrMK基因的克隆

以滇龙胆幼叶cDNA为模板，使用特异性引物GrMKBamH I-F和GrMKXho I-R扩增出约1 200 bp的片段。通过TA克隆获得重组质粒pMD19-GrMK。

2.2 GrMK基因的生物信息学分析

利用Genetyx和DNAMAN软件对GrMK基因序列进行分析，结果显示GrMK基因ORF为1 138 bp，编码387个氨基酸。将该序列上传至GenBank数据库，获得登录号KJ917167。

使用GenBank数据库BLASTp程序对GrMK蛋白进行相似性分析，结果表明滇龙胆GrMK与长春花CrMK蛋白序列相似性最高（85.79%），与拟南芥AtMK （67.29%）蛋白相似性较低。利用DNAMAN 7将GrMK蛋白氨基酸序列与NCBI中相似性较高的部分序列进行多序列比对分析，结果表明GrMK蛋白与已知蛋白序列保守性较高（图1）。利用Mega 6.0将GrMK蛋白与NCBI中相似性较高的部分序列和文献已报道的部分序列进行系统发育分析，结果显示滇龙胆GrMK蛋白与长春花CrMK处于同一进化枝（图2），表明二者亲缘关系较近。

使用ProtParam tool对GrMK蛋白进行分析，结果表明GrMK蛋白单体相对分子质量41.12 kD，这与长春花CrMK单体40.50 kD和拟南芥AtMK单体40.70 kD大小相类似[5]；pI为5.34；带正电氨基酸残基（Arg+Lys）为30，带负电氨基酸残基（Asp+Glu） 为30， 化学方程式为：C1817H2936N476O562S21。不稳定指数为31.22，属于稳定蛋白；脂肪指数为100.57，总平均疏水性（ GRAVY）为0.21，为疏水蛋白。GrMK蛋白含有20种基本氨基酸，其中亮氨酸和丝氨酸含量最高，均为10.60c/0；其次是丙氨酸和甘氨酸，分别为9.00%和8.800/0；色氨酸含量最低，为1.00%。

利用SSpro方法对GrMK蛋白进行二级结构分析，结果表明该蛋白二级结构中d一螺旋（H）占40.830/0，无规则卷曲（C）占40.31010，延伸带（E）占18.860/0。利用Swiss-Model Workspace使用自动模式预测GrMK蛋白的三级结构，结果如图3，该模型以甲烷八叠球古菌甲羟戊酸激酶[4hacA]为模板，在第2-382氨基酸处建模，序列相似度为22.51%。使用InterPro在线工具对GrMK蛋白的保守结构域进行分析，结果表明GrMK蛋白包含5个保守结构域，它们分别为：甲羟戊酸激酶伴乳糖激酶结构域（7-31，136-158，193-212，330-347）、甲羟戊酸激酶结构域（6-384）、乳糖激酶/高丝氨酸激酶/甲羟戊酸激酶/磷酸甲羟戊酸激酶（ GHMP kinase）N端结构域（133-212）、GHMP激酶ATP结合结构域（13 8一149）和GHMP激酶C端结构域（294-350）。

利用SignalP 4.1服务器分析GrMK蛋白，未发现信号肽，表明该蛋白为非分泌型蛋白。利用TMHMM工具预测GrMK蛋白的跨膜螺旋区，结果表明GrMK蛋白不含有跨膜区域（图4），为非膜蛋白。使用CldoroP在线软件对叶绿体转运肽进行预测，结果表明GrMK蛋白不含叶绿体转运肽。使用WoLF PSORT软件进行亚细胞定位分析，结果为GrMK蛋白在细胞核、叶绿体和细胞质的定位系数分别为8.0、4.0和2.0，这与文献报道的MVA途径存在于细胞质中的结论相矛盾[3]。

对GrMK基因进行稀有密码子分析，结果表明GrMK基因中稀有密码子仅占0.78010，且无二联或三联稀有密码子连续出现的情况，因此可选用表达菌BL21或Rosetta （DE3）进行原核表达。

2.3 GrMK基因原核表达载体的构建

使用BamH I和Xho I双酶切质粒pGEX-4T-1-GrMK，可切出目的片段和载体（图5），表明Gr MK基因已成功插入载体pGEX-4T-l。

2.4 GrMK基因的原核表达

将重组质粒pGEX-4T-l-GrMK转化大肠杆菌Rosetta（ DE3）后，进行IPTG诱导表达。在37 0C、终浓度为1 mmol/L IPTG下，分别诱导表达Oh、2h、4h和6h后，提取细菌总蛋白进行SDS -PAGE分析。结果表明，与对照相比，pGEX-4T-l-GrMK转化菌经IPTG诱导后，在相对分子质量67.12 kD（含GST标签蛋白26.00 kD）左右有1条蛋白条带，并且随诱导时间增加其蛋白含量逐渐增加，表明重组质粒pGEX -4T-1-GrMK在大肠杆菌Rosetta（ DE3）中成功诱导表达了GrMK蛋白。当温度为37 0C、诱导时间为6h时，蛋白表达量最大（图6），可直接用于下一步的蛋白纯化。

2.5 GrMK基因的组织表达分析

取3年生滇龙胆的根、茎和叶，通过实时定量RT-PCR分析GrMK基因在不同组织中的表达情况。结果表明，GrMK基因在根中表达量最高，约是茎和叶的2倍和485倍；其次是茎，表达量最低的是叶（图7）。

3讨论

MVA途径能够为滇龙胆药效成分龙胆苦苷的生物合成提供前体物质。MK是MVA途径的第一个限速酶[6，11]，因此，滇龙胆中GrMK基因的表达情况直接或间接影响龙胆苦苷的生物合成。研究表明，植物中MK蛋白如三七PnMVKlc[11]、林烟草NsMKc[13]、杜仲ELIMK[1 2]均包含GHMP激酶N端、C端结构域和ATP结合结构域。本研究从滇龙胆幼叶中克隆了GrMK基因，蛋白序列比对分析结果表明GrMK蛋白属于MK家族蛋白，在其N端、中部和C端分别具有3个保守结构域：GHMP激酶N端结构域（133-212）、GHMP激酶ATP结合结构域（138-149）和GHMP激酶C端结构域（294-350）。这些结果表明所克隆基因为滇龙胆甲羟戊酸激酶基因。

基因编码蛋白的活性形式和亚细胞定位对蛋白功能执行都有很大影响。在生物界，MK活性蛋白以单体或二聚体的形式在体内起作用。在詹氏甲烷球菌中，MjMK单体蛋白为36.00 kD，而其活性形式为二聚体，相对分子质量为68.00 kD[19]；在长春花中，其蛋白单体和活性形式相对分子质量分别为40.50 kD和104.60 kD；在酿酒酵母中，其单体蛋白即为其活性形式，相对分子质量为40.80 kDc20]。在本研究中，GrMK单体相对分子质量为41.12 kD.其活性形式需要通过非变性SDS-PAGE进行进一步检测。在人类、拟南芥和长春花中，MK蛋白均定位于细胞质[3，8，21]。在本研究中，生物信息学分析结果表明GrMK蛋白定位于细胞核的可能性最大，这与三七PnMK蛋白预测结果一致[11]但该结果与其功能作用并不相符，需通过融合GFP标签进一步验证其亚细胞定位。在拟南芥整个发育过程中，AtMK基因在各个组织中均表达，但在根分生组织中表达量最高[22]。组织表达特异性检测结果表明，Gr MK基因在根中表达量最高，因此推测滇龙胆根部为MVA途径较为活跃，并为龙胆苦苷生物合成提供前体物质。滇龙胆用药部分为根，因为与叶和茎相比，根中龙胆苦苷含量最高[23]这也为上述假说提供了证据。

本研究为滇龙胆GrMK基因功能的解析奠定基础。下一步将对GrMK蛋白进行纯化和酶活分析，通过互补试验或过表达研究Gr MK基因功能，为龙胆苦苷生物合成途径及其调控机理的阐明奠定基础。