新疆维吾尔族人群过氧化物酶体增殖物激活受体基因相关SNP位点的多态性

祖克拉·肉孜 宋曼殳 布帕提玛穆·阿布都克热穆 伊力哈木·乃扎木

多力坤·买买提玉素甫

摘 要：对过氧化物酶体增殖物激活受体基因（PPARG）的31个SNP位点进行群体遗传学分析，利用质谱检测技术检测PPA RG基因的31个SNPs位点多态性，并根据质谱峰图判读样本目标位点基因型，统计分析31个SNP位点的基因型和等位基因的分布频率，利用x2检验确定筛选的SNP位点是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。结果发现31个SNP位点中，23个位点的次等位基因分布频率MAF≥0.05，在新疆维吾尔族人群中具有多态性，其他8个SNP位点的MAF< 0.05，没显示多态性。基因型和等位基因频率在男女两组间均无统计学差异（p>0.05），表明这些位点等位基因分布不存在性别差异。

关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体（PPA RG）；SNP位点；维吾尔族人群

中图分类号：Q39

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2015）03-0189-07

单核苷酸多态性（single nucleotide polymor-phisms，SNPs）是指人类基因组中单个碱基的变异，推测人类基因组至少有210万个SNPs[1]。SNPs是人类种族差异、个体差异的分子基础，成为第三代多态性标记，是基因组多样性和识别及定位疾病相关基因的一种新型手段[2]。SNPs数量大、分布广，在人类30亿碱基中有约3x106个SNPs位点，在任何已知或未知疾病基因附近都可能找到众多的SNPs[1]。应用高密度的SNPs图谱，通过相关分析或连锁分析可以定位一系列多基因疾病，如糖尿病、高血压、哮喘、癌症等的主基因。因此，人们希望通过研究SNP图谱，更深刻地认识癌症、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等发病率高的多基因疾病的发生机制[2，3]。

过氧化物酶体增殖物激活受体PPA RG基因定位于3p25，属于转录因子的核激素受体超家族，主要表达于脂肪组织，调节脂肪细胞的分化过程，参与脂肪细胞的凋亡，PPA RG基因功能缺失突变可以导致脂肪萎缩，在脂肪细胞特异基因的表达和调节胰岛素敏感性方面发挥着重要作用[4]。PPA RG也可能成为肥胖、高血压、动脉粥样硬化的新型治疗靶点[5-9]。研究提示其可能在脂肪细胞分解、能量消耗及炎症反应中发挥重要作用[4，10-14]。目前认为PPA RG在人体能量代谢的调节控制中起核心作用，直接影响到葡萄糖进入三羧酸循环、葡萄糖胺生成速率和组织的糖异生能力，经大样本荟萃分析显示单核苷酸多态性（SNPs）与2型DM易感性相关[15-19]。

至今虽然在不同种族报道了PPARG基因多态性方面的很多关联研究，但研究结果不一致，且研究位点多集中于少数几个常见SNP有报道。为此，本研究探讨新疆维吾尔族健康人群PPA RG基因的31个SNP位点的多态性，为进一步研究基因多态性与相关疾病发病危险性和前瞻性研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1样本

采自在新疆地区民丰县县医院体检的健康维族人群无关个体50例，要求所有调查对象均在所在地区居住3代以上，无血缘关系，年龄>40岁，家庭婚姻史为世代族内通婚。自肘静脉采血3 mL加0.5 mL ACD抗凝，充分混匀后放人-20°C冰箱冷藏室保存备用。

1.2主要试剂和仪器

基因扩增：ABI Gene Amp@9700 384 Dual，质谱点样：Mass ARRAY Nan dispenser RS1000；质谱分析：Mass ARRAY Compact System；试剂：Complete Genotyping Reagent Kit for Mass AR-RAY@ Compact 384。

1.3方法及步骤阐述

1）基因组DNA提取及DNA样品浓度和纯度质检：采用北京Transgenic Biotech有限公司的EasyPureTM Blood Genomic DNA Kit试剂盒。分离出的DNA用琼脂糖凝胶电泳法检验，并通过紫外分光光度计检测OD260 /OD28080数值，调整DNA终浓度在30～50 ng/μL之间。 2）引物设计及引物稀释：根据SNP位点通过美国Sequenom公司的Assay Design 3.1软件进行引物设计；通过质谱预实验进行延伸引物质检，将引物稀释到质谱反应所需浓度。PCR引物储备液制备：配置PCR引物储备液，终浓度为100 μmol/L；单碱基延伸引物储备液制备：配置单碱基引物储备液，终浓度为500 μmol/L；引物设计详细（见表2）。

3） PCR反应：5μL的PCR反应体系中含有ddH20 1.8 μL，10* buffer 0.5μL，Mg2+ 0.4 μL，dNTP 0.1 μL，Hot star 0.2μL，F Primer/R Primer 1μL，基因组DNA样品（20—50 ng），至终体积5μL。PCR扩增反应条件：95℃2 min预变性，95 0C 30 s，56 0C 30 s，72 0C 60 s*45个循环；72 0C 5 min；25 aC∞。

4） SAP酶消化反应：按照下述顺序配制SAP酶Mix：总体积2x460，dddH20 1.53x460pLL，SAP Buffer 0.17x460 μL，SAP Enzyme 0.3x460μL，下一步在PCR仪中按照下述程序进行SAP酶消化：37 0C 40 min，85 0C 5 min，25 0C ∞。

5）单碱基延伸反应：按照下述顺序配制单碱基延伸反应Mix：三蒸水0.619x460 μL，lOx iplex buffer 0.2x460 μL，Terminator mix 0.2x460μL.引物0.94x460 μL，单碱基延伸酶0.041x460 μL，至终体积2x460 μ1。下一步在PCR仪中按照下述程序进行单碱基延伸反应：预变性94℃30 s，分别为94 °C 5 s，52℃Ss进行40个外部循环，分别为80 °C 5 s，72 0C 3 min进行40个内部循环，25 °C ∞。

6）树脂纯化：将反应产物的384孔板中加入16 μL三蒸水，在离心机中离心2 000转离心3 min；加入树脂，在反转摇匀仪上做树脂纯化反应35 min，脱盐；反应完成后在离心机中离心2 000转离心3 min。将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。

7）进行质谱检测，并收集数据：MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解析电离飞行时间质谱）反应；Typer 4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。1.4统计学处理

将所有完成的问卷统一编码，使用SPSS Data Entry 2.0软件建立数据库。所选SNP位点群体基因型经Hardy-Weinberg平衡检验。采用直接计数法对各个SNP位点在新疆维吾尔族人群中的频率分布进行统计。采用X2检验进行男女两组之间的基因型及等位基因频率分布特征的比较。

2 结果

1） SNP位点借于MAF值进行Hardy -Wein-berg遗传平衡定律检验。

一般以P=0.05作为显著性水平的界值，P>0.05说明所调查的群体达到遗传平衡，即本次群体调查的数据可信；SNP分子标识的选择依据：①最小等位基因频率（MAF）≥0.05；②PPARG与多代谢异常有关的SNP；③所选的SNP位于基因片段功能区或可能改变功能的区域[19J。X2检验中自由度的法则为：由于总的理论数必须等于总的实际数（作为限制条件，必须从总的自由度中减1），需要估计的参数实际上只有等位基因频率a，其余等位基因和全部基因型频率都可以由其推算出，所以需要估计的参数数目为1，df=总的分类数（即基因型的数目）一1（需要估计的参数数目1。PPA RG基因所筛选的SNPs位点中除了rs4135329、rs4135356、rs4135354、rs6805419、rs -9870196、rs17036700、rs4135304、rs4135343位点以外，其他23个位点均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性（P>0.05）（见表1）。

2）对新疆地区50例维吾尔族无关个体进行SNP分型检测获得31个SNP位点的基因型。

采用直接记数法计算，得到每个位点的最小等位基因频率（MAF）。rs4135329、rs4135356、rs4135354、rs6805419、rs9870196、rs17036700位点第1个等位基因频率为1，第2个等位基因频率都为0。rs4135304、rs4135343位点第1个等位基因频率为0，第2个等位基因频率都为1（见表3）。

3）进一步对具有多态性的23个位点进行基因型频率分布计算。

在23个SNP位点中，rs1899951、rs2292101、rs-2881654、rs1801282等位点的第一个纯合体基因型频率最高，频值0.74，rs6782475、rs7626560等位点的第一个纯合体基因型频率最低，频值均为0。在杂合体中rs17036242、rs7615916、rs9310401等位点的杂合体基因型频率最高，频值分别为0.60、0.63、0.60。rs6782475位点杂合体基因型频率最低，频值均为0.12。在第2个纯合体中，rs3856806、rs6782475等位点的基因型频率最高，频值分别为0.68、0.88。rs17036242、rs1899951、rs-2292101、rs2881654、rs9310401、rs1801282等位点基因型频率最低，频值均为0—0.02（见表4）。

4）采用SPSS软件X2检验进行男女两组之间的基因型及等位基因频率计算。

在rs2292101位点第2个纯合体的基因型在男和女都为0，所以无法进行卡方检验，rs6782475、rs7626560位点第一个纯合体的基因型在男和女都为0，所以无法进行卡方检验，其他位点的基因型和等位基因频率在男女组间的差异均未达到统计学意义（P>0.05）（见表5）。

3讨论

过氧化物酶体增殖物活化受体y（PPA R-y），也称胰岛素增敏剂受体，是一种位于人类染色体上的二型核受体，由PPARG基因编码，对脂肪细胞和胰岛素有重要的作用，是治疗糖尿病的研究对象之一[16-22]。PPA R-y通过JAK -STAT、激活蛋白-1（AP-1）、NF-rd3、活化T细胞核因子信号通路（NFAT）来抑制炎症反应；通过抑制泡沫细胞的分化、炎症反应以及细胞增殖来抑制动脉粥样硬化的发生发展；通过磷脂酰肌醇三激酶（P13K）、瘦素、脂链素等信号通路来参与糖稳态的调节；通过细胞周期的调控来影响肿瘤生长；参与脂肪细胞分化并与肥胖密切相关。明确这些相关信号通路以及相关细胞因子的作用，可对相关疾病机制及防治进一步提供有力依据和干预途径[23]。

代谢综合征是临床上具有肥胖、高血压、血脂紊乱、受损的糖耐量或糖尿病以及胰岛素抵抗等一系列代谢失常症状的并称，是多种代谢成分异常聚集的的病理状态。引起上述代谢失常症状的因素有很多，包括胰岛素抵抗、炎症反应、脂肪组织分泌的各种细胞因子的参与、生活方式及遗传因素等，但其根本原因还是能量代谢的失衡[24-26]。因此，代谢综合征治疗手段的探索和相关药物的开发已成为国内外科学工作者关注的热点。

本研究中，从新疆维吾尔族人群50例无关个体提取血液DNA，使用Haploview 4.1分析软件，对过氧化物酶体增殖物激活受体（ PPARG）相关SNP位点筛选，为了避免由于SNP的MAF过低而产生的统计偏倚，首先考虑纳入（最小等位基因）MAF>0.05的多态位点，并根据多人群研究情况选择热点多态性位点优先进入候选分型。结果显示，筛选的31个位点中rs1151999、rs1175540、rs17036242、rs1875796、rs1899951、rs2292101、rs -2881654、rs2921190、rs2938397、rs2959272、rs295 -9273、rs2972162、rs3856806、rs4135247、rs4135275、rs4684846、rs6782475、rs709151、rs7615916、rs76 -26560、rs9310401、rs9817428、rs1801282等23个位点具有多态性。在男女组间23个SNP位点的基因型和等位基因频率差异均没达到统计学意义（P>0.05）。

目前，我们只是对以上SNP位点在新疆维吾尔族人群的多态性特征进行了调查，为进一步的群体遗传学的研究和基因多态性普查奠定了基础，并为今后进行疾病前瞻性研究提供了重要的基础资料，但是，这些位点与过氧化物酶体增殖物激活受体的相关性如何，有待于进一步研究。

参考文献（References）：

[1] 王娟.人类基因组SNPs的研究现状及应用前景[J].生命科学（WANG Juan. Prospects and progress on single nucleotide polymorphisms in human genome[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences）， 2006，18（4）： 397-401.

[2] 陈菁，孙桂芹.单核苷酸多态性在多基因遗传病研究中的作用[J]中国微生态学杂志（CHEN Jing ，SUN Gui-qin. The role of single nucleotide polymorphisms in the study of che complex genetic diseases[J]. Chinese Medical Journal），2007，4（19）： 229-

231.

[3] 张奎星，刘同宝，徐秋霞，血管紧张素Ⅱ1型受体基因单核苷酸多态性与原发性高血压和冠心病的相关研究[J].中华心血管病杂志 （ZHANG Kui-xing， LIU Tong-bao，XU Qiu-xia.Association of angiotensin II receptor type l gene nucleotide polymorphism with Chinese essential hypertension complicated with coronary heart disease[J]. Chinese Journal of Cardiology），2005，8（33）： 720-723.

[4] 唐新，林婴，黄文芳.PPA RG基因单核苷酸多态性与2型糖尿病血脂异常的相关性研究[J]检验医学（TANG Xin LIN Ying， HUANG Wen-fang. The investigation of relationship between PPARC gene single nucleotide polymorphism andblood lipid abnormality in patients with type 2 diabel，ic mellitus[J].Laboratory Medic，ine），2009，3（24 ）：190-193.