BD2增强巨细胞病毒DNA疫苗的免疫效果研究

刘腊兰 彭波 黄超洋 唐菁菁 方芳 常海艳 张风华

摘要：表达巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）即刻早期蛋白（IE-1）的DNA疫苗能抵抗巨细胞病毒的感染。β防御素2型（BD2）能激活未成熟的树突状细胞，调节机体免疫反应。以小鼠为动物模型，探讨小鼠13D2（mBD2）增强鼠巨细胞病毒（murine cytomegalovirus，MCMV） IE-1 DNA疫苗的佐剂效果。将表达IE-1的质粒（pIE-l）与表达mBD2的质粒（pBD2）混合免疫小鼠，2周后用致死量的同源MCMV攻击小鼠。通过检测发现，混合免疫pIE-l和pBD2的小鼠与单独免疫IE-1相比，血清中IE -1特异性抗体含量升高，脾脏CD8+T细胞所分泌的IFN-y水平上升，小鼠体重丢失明显下降，病毒攻击后小鼠存活率也有所提高。这些结果表明，BD2可以作为一种分子佐剂增强IE-1 DNA疫苗的免疫效果。

关键词：巨细胞病毒；即刻早期蛋白；DNA疫苗；p防御素2型

中图分类号：R373.1+3； 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）03-0224-05

巨细胞病毒（ cytomegalovirus，CMV）是一类双链DNA病毒，属于β疱疹病毒亚科。CMV可致多种哺乳动物感染，引起中枢神经系统、泌尿生殖系统等损伤。人巨细胞病毒（ human cytomegalovirus，HCMV）在人群中普遍易感，但一般没有明显的临床症状，而在免疫低下的AIDS患者、免疫抑制的器官移植患者或婴幼儿中，HCMV可引起严重的临床症状甚至导致死亡[1，2]。目前还没有HCMV疫苗在临床上使用，有效预防感染的HCMV疫苗是当前的研究热点。已经进入临床2期试验的HCMV疫苗只有两种：联合新型MF59佐剂的包膜糖蛋白gB亚单位疫苗和pp65与gB DNA二价疫苗[3，4]。巨细胞病毒即刻早期蛋白（IE-1）DNA疫苗作为研究对象之一，单独免疫机体时不能提供很好的保护。因此，寻找一种合适有效的佐剂来增强其免疫效果很有必要。

防御素作为机体防御系统的成分，是一类富含精氨酸和半胱氨酸的小分子多肽。防御素除了抗病原微生物和抗毒素作用外，还具有抗病毒作用，能在对抗单纯疱疹病毒、流感病毒、艾滋病病毒等包膜病毒感染中发挥作用[5，6]。此外防御素还具有免疫调节作用，小鼠BD2 （mBD2）能通过TLR4受体来促进未成熟树突状细胞的成熟；人β防御素3型（hBD3）能通过TLR1和TLR2诱导CD80、CD86和CD40在髓样树突状细胞表面的表达[7]。防御素除了与趋化因子受体及Toll样受体共同作用外，还能诱导表达大量的细胞因子和促炎因子如TNF-a、IFN-y、IL-2、IL-8和IL-18等，进而调节免疫应答[8，9]。

为探明BD2对IE-1 DNA疫苗免疫效价的影响，以小鼠为动物模型，将表达mBD2的质粒（ pBD2）与表达IE-1的质粒（pIE-l）混合免疫BALB/c小鼠，通过检测小鼠的血清抗体、脾脏IFN-γ、存活率、体重丢失及器官病毒滴度来评价BD2对IE-1 DNA疫苗的佐剂效果。

1 材料与方法

1.1 病毒与小鼠

MCMV的Smith株由本实验室保存，小鼠体内扩增传代。实验中所用小鼠为6～8周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠（由湖南师范大学生命科学学院SPF级动物房饲养）。

1.2质粒构建

实验中所用的pIE-l DNA疫苗由本实验室人员构建，系将MCMV Smith株IE1基因插入pcDNA3.1真核表达载体中得到[10]。

小鼠β防御素2型（mBD2）基因由上海生物制品所提供（GenBank登录号为No. AJ011800）。利用Primer 5.0进行引物设计，由上海生工生物公司合成。其中正向引物mBD2-F： CGgaattcCTCT-CTGGAGTCTGAGTGCC，反向弓l物mBD2-R： GC-LctagaTTTATTGAAACATCAATTACACATC.mBD2的PCR反应体系为：高灭纯水16.8 μL，Pfu Buffer2.5 μL，dNTP 2.5 μL，cDNA模板1 μL，mBD2sense primer 1 μL，mBD2 anti-sense primer lμ1，Pfu酶0.2 μL。PCR反应条件：变性94 °C 30 s，退火55 度C 30 s，延伸72 度C 45 s，30个循环。PCR产物回收后，插入pCDNA3.1真核表达载体，构建pcDNA3.1-mBD2的重组质粒（以下简称pBD2）。

1.3免疫与攻毒

实验共分为4个组，其中3组分别免疫50μg pIE-l、10μg pBD2和50 μg pIE-l +10 μgpBD2，剩下一组不免疫作为阴性对照。免疫的方法均为肌肉注射辅以电穿孔法l¨I。免疫两周后，用致死量（3xLDso） MCMV腹腔感染小鼠。攻毒后的21 d内观察小鼠体征变化，并记录每组小鼠体重丢失情况和死亡情况。

1.4 IE-1特异性抗体检测

免疫两周后，剪尾取血收集血清样本，ELISA法检测IE1特异性抗体含量。96孔板中反应物依次加入：1）含IE1蛋白的包被液；2）连续2倍稀释的血清；3）生物素标记的羊抗鼠IgG抗体；4）碱性磷酸酶标记的链菌蛋白；5）pNPP显色液；6）酶标仪中测出波长为405～450 nm处的吸光值。以对照组血清吸光值的x+2s作为实验组血清抗体阳性的临界值。

1.5脾脏细胞分泌IFN-y检测

免疫10 d后，无菌操作摘取小鼠脾脏，分离脾脏淋巴细胞用于检测IFN-γ的量。使用深圳市达科为生物技术有限公司的Mouse IFN-y Pre-coated ELISPOT kit并按使用说明操作如下：1）96孔ELISPOT包被板的活化；2）每孔按2xl05加入细胞悬液；3）每孔加入4μg的MCMV IE-1抗原的CD8T细胞表位肽168-YPHFMPTNL-176（H2d限制型，由上海生工生物技术公司合成）；4）37 0C，5% C02培养箱孵育20 h；5）冰冷的去离子水裂解细胞；6）加人生物素标记的二抗孵育；7）加入酶联亲和素孵育；8） AEC显色液显色；9）终止显色；10） ELISPOT斑点计数。读板所得斑点数用于分析脾脏细胞分泌IFN-y的情况，以此评价小鼠体内细胞免疫水平。

1.6器官病毒滴度测定

攻毒后的第5d与第21 d，收集小鼠脾脏和唾液腺，病毒稀释液冰上无菌研磨，匀浆液离心后，上清-80 0C保存。24孔板中的NIH-3T3细胞生长至80%左右，匀浆上清按10倍系列稀释后，各稀释度按每孔100 μL感染3T3细胞。5% C0237 0C孵育th后加入粘性培养基。待细胞形成明显的病毒斑时，根据每孔中病毒斑的数目，计算出各样本器官中的病毒滴度（ pfu/mL），每组小鼠病毒滴度值以x±s值表示。

1.7统计学分析

实验数据的评定用Student's test方法，以P<0.05定为统计学显著性差异。存活率是否有意义用Fisher's exact test方法比较实验组和对照组小鼠来确定。

2实验结果

2.1 混合免疫pIE-l和pBD2后IE-1特异性抗体检测

小鼠免疫一次，免疫2周后，剪尾取血收集小鼠血清，用ELISA的方法检测抗IE-1特异性IgG抗体。如表1所示，小鼠经pIE-l单独免疫后可以检测到血清特异性IgG抗体，经pIE-l和pBD2混合免疫后小鼠血清中IgG抗体滴度升高，与单独的pIE—l免疫组相比具有显著差异，说明mBD2对IE-1 DNA疫苗在小鼠体内抗体应答有免疫增强作用。

2.2 混合免疫pIE一1和pBD2后小鼠的细胞免疫反应

免疫10 d后用ELISPOT的方法检测小鼠体内分泌IFN-y的脾脏淋巴细胞数量，ELISPOT斑点数代表IE-1特异性细胞免疫应答水平。如图1所示，混合免疫pIE-l和pBD2组及单独免疫pIE-l组小鼠分泌IFN-y的脾脏细胞量均比对照组高，两者与对照组相比均有显著性差异。且混合免疫pIE-l和pBD2后小鼠体内分泌IFN-γ的脾脏细胞数目明显提升，达到每2xl05个脾脏细胞805个斑点，与单独免疫pIE-l组小鼠（每2xl05个脾脏细胞438个斑点）相比有显著性差异。说明pBD2质粒混合pIE-l DNA疫苗免疫小鼠后，能增强机体细胞免疫反应。

2.3致死剂量病毒攻击后小鼠存活率及器官病毒滴度

免疫2周后用致死剂量同源病毒攻击小鼠，攻毒后21 d内观察各组小鼠的死亡情况。如图2中所示，空白对照组与pBD2单独免疫组小鼠，均在攻毒后7d内全部死亡。单独免疫pIE-l对小鼠的保护率为400/0，而混合免疫pIE-l和pBD2对小鼠的保护率达到700/0，混合免疫组与对照组小鼠存活率相比有显著性差异。攻毒后第5d和第21 d分别取小鼠脾脏和唾液腺，噬斑测定法检测攻毒后小鼠脏器中的病毒滴度。结果如表2所示，混合免疫pIE-l和pBD2的小鼠攻毒后体内的病毒滴度明显比单独免疫pIE-l的小鼠低，两者相比有显著性差异。且小鼠单独免疫pBD2，攻毒后脾脏病毒滴度也比对照组小鼠低，两者相比也有显著性差异。结果表明mBD2能增强IE-1DNA疫苗对小鼠的保护作用，mBD2也具有抗病毒作用。

2.4 攻毒后小鼠体重变化

以病毒攻击小鼠当天作为第Od，当天体重视为原始体重，21 d内小鼠体重丢失值与原始体重的比值作为体重丢失率。结果如图3所示，对照组小鼠及pBD2免疫的小鼠第5d时体重丢失达到30%以上，pIE-l单独免疫的小鼠体重丢失达到26%，而混合免疫pIE-l和pBD2的小鼠体重丢失虽也达到240/0，但第7d时体重开始回升，而单独免疫pIE-l组小鼠体重7d之后才开始回升。说明pIE-l和pBD2混合免疫小鼠后，能降低小鼠体重丢失，加速感染后的体重恢复。

3讨论

在本研究中我们用pIE一1 DNA疫苗与pmBD2质粒共同免疫BALB/c小鼠，两周后用致死剂量同源病毒攻击。二者共同免疫的小鼠与IE-1 DNA疫苗单独免疫组相比，IE-1特异性抗体滴度增加且小鼠脾脏中分泌IFN -y的淋巴细胞数目明显增多。攻毒后混合免疫组小鼠体内残留的病毒滴度比pIE-l单独免疫组低；且混合免疫对小鼠抗致死剂量MCMV感染的保护率比pIE-l组高。这些结果均可以证明mBD2作为IE-1 DNA疫苗的分子佐剂，能起到免疫调节作用增强机体免疫反应。

巨细胞病毒即刻早期蛋白IE-1，是病毒感染宿主后表达的早期基因产物。鼠巨细胞病毒IE-1蛋白，能在BALB/c小鼠中诱导IE一1特异性CD8+T细胞反应，对小鼠抵御MCMV感染有一定的保护作用[12]。我们之前关于巨细胞病毒DNA疫苗在BALB/c小鼠中免疫效果的比较，发现100 μgpIE-l DNA疫苗单独一次免疫小鼠时，对小鼠抗致死剂量MCMV感染的保护率为68%[10]。而50 μgpIE-l DNA疫苗单独一次免疫小鼠时，对小鼠抗致死剂量MCMV感染的保护率只有50%[13]。在我们的试验中，50 μg pIE-l DNA疫苗与10 μgpBD2质粒混合免疫小鼠时，对小鼠抗致死剂量MCMV感染的保护率达到70%，比100 μg pIE-lDNA疫苗单独一次免疫对小鼠的保护率更高。我们的实验结果与Valtanen等的研究结果一致。他们用2μg表达斑马鱼β防御素2型（zfBD2）的质粒免疫斑马鱼后用鲤春病毒（SVCV）攻击，被感染的斑马鱼的病毒滴度要比对照组的低20倍。此外，用1μg gpG DNA疫苗与0.5 μg zfBD2质粒共同免疫斑马鱼，后用SVCV病毒攻击，对斑马鱼的保护率明显提高，甚至比10 μg的DNA疫苗单独免疫斑马鱼的保护率更高[14]。Biragyn等的实验证明，用表达hBD2的HIV gP120 DNA疫苗免疫小鼠，能在小鼠体内诱导全身性和粘膜免疫的CD8+T细胞反应[15]在老年鼠模型中mBD2能刺激机体分泌高水平的INF-y提高细胞免疫应答，从而增强HAd-HA-NP疫苗对小鼠抗H5Nl的保护效果[16]。而我们的实验中混合免疫pIE-l和pBD2也能提高小鼠分泌INF-Y的水平，增强机体CD8+T细胞反应。Gong等发现，用重组的鼠β防御素2型（rmBD2）处理过的PR-8病毒去攻击小鼠时，小鼠的死亡率只有300/0。而用未处理的病毒去攻击小鼠，小鼠的死亡率达到l00%[17]；Sun等发现人β防御素不仅能直接灭活HIV病毒，且hBD2能抑制HIV病毒在细胞内的传播唑而我们的实验中，单独免疫10 μg pBD2的小鼠脾脏病毒滴度比对照组低，两者相比有显著性差异，也说明mBD2具有抗病毒效果。

防御素之所以能起到免疫调节作用增强机体免疫反应，很有可能是因为它能在免疫部位募集DC细胞，而DC细胞能直接激活趋化因子受体，而且在先天性免疫和获得性免疫之间具有重要的桥梁作用[19]。DC细胞最大的特点就是能够显著性刺激初始T细胞增殖，因此DC细胞是机体适应性T细胞免疫应答的始动者。而研究表明，hBD3通过CCR7受体促进朗格汉斯样细胞如树突状细胞（LC -DCS）的成熟，增强CCL19和CCL21的趋化反应并促进初始T细胞分泌IFN-γ[20]。mBD2可通过CCR6受体来趋化和聚集iDC和其他的免疫细胞如巨噬细胞、单核吞噬细胞、NK细胞[21]。mBD2能结合TLR4受体促进iDC的成熟，DC分泌IL-12诱导初始T细胞分化为Thl型细胞。Thl分泌IFN -y、TNF-α、IL-2、IL-3等细胞因子发挥免疫调节的作用，从而增强机体诱导产生特异性抗体的水平及有效的细胞免疫反应[22，23]。

本研究在小鼠模型上证明了mBD2可以作为分子佐剂增强巨细胞病毒IE-1DNA疫苗的免疫应答，提高小鼠对致死量病毒感染的免疫保护能力。该结果为人类巨细胞病毒疫苗的研究提供了实验参考。