贵阳地区224 例哮喘儿童IL-17A-152G/A 位点基因多态性及与哮喘易感性的研究*

曾 艳，李 波，杨 俊，夏梦青，朱晓萍＊＊

(1.贵州医科大学 儿科学教研室，贵州 贵阳 550004;2.贵州医科大学附院 儿科，贵州 贵阳 550004)

支气管哮喘(简称哮喘)在儿童中的患病率呈逐年上升趋势［1］，该病是一种慢性气道炎症性疾病，由多种细胞及细胞因子参与，以气道炎症和气道重塑为主要病理特征，慢性炎症与气道高反应性相关，气道高反应性可导致反复喘息发作、呼吸困难、胸闷和咳嗽(尤其是在夜间和凌晨)。白细胞介素-17(IL-17)是一种前炎性细胞因子，是T 淋巴细胞诱导的炎性反应的早期启动因素，能诱导和激活中性粒细胞在呼吸道的募集，为明确IL-17 基因与贵阳地区儿童哮喘的相关性，本研究采用病例对照的方法、PCR-RFLP 技术检测技术，探讨IL-17A基因-152G/A 位点的多态性及其与贵阳地区儿童哮喘发病的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象与分组

哮喘组为2012 年11 月～2015 年1 月确诊支气管哮喘的患儿224 例，符合儿童支气管哮喘诊断与防治指南诊断标准［2］，男152 例，女72 例，平均(6.11±3.27)岁。对照组为同期门诊健康体检儿童150 例，男93 例，女57 例，平均(5.61±3.55)岁，对照组儿童均排除哮喘病史、家族哮喘、过敏性疾病史和其他过敏性疾病史。两组儿童均在贵阳居住半年以上，采血前4 周内未静脉使用糖皮质激素，且均无血缘关系。

1.2 主要仪器及试剂

Eppendorf 聚合酶链反应(PCR)仪(德国艾本德公司)，BeckmanDU640 型核酸蛋白分析仪(Beckman 公司)，G:BOX 凝胶成像系统(基因有限公司)，DNA 提取试剂盒和2×Taq PCR MasterMix［天根生化科技(北京)有限公司］，引物合成(北京鼎国生物技术有限责任公司)，PdmⅠ内切酶(赛默飞世尔科技)，500 bp DNAMarker［宝生物工程(大连)有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 全血DNA 提取 取空腹静脉血3 mL，4 ℃静置2 h，血凝块用DNA 提取试剂盒(离心柱型，DP335)提取全血DNA。

1.3.2 引物设计 参照GeneBank 中人IL-17A DNA 序列编号(NC_000006.12)，根据rs2275913在美国国立生物技术信息中心网站上查询-152G/A 位点的基因序列，参考文献［3－4］确定突变位点，用Primer Premier5.0 软件设计引物。

1.3.3 IL-17A 基因-152G/A 位点PCR-RFLP 检测

上游引物序列为5'-CAG AAG ACC TAC ATG TTA CT-3'，下游引物序列为5'-GTA GCG CTA TCG TCT CTC T-3'。PCR 目的片段扩增PCR 反应体系:25 μL 反应体系含2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.8 μL，50 mg/L DNA模板2 μL，ddH2O 8.9 μL。PCR 反应条件94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共30 次循环，72 ℃最后一次延伸5 min，反应产物用2%琼脂糖凝胶水平电泳判断是否扩增成功。扩增产物的限制性片段长度多态性分析:15 μL酶切体系含PCR 产物5 μL，10×FastDigest Green Buffer 1 μL，限制性内切酶PdmⅠ(FastDigest PdmⅠ)0.5 μL，ddH2O 8.5 μL，置于37 ℃恒温水浴箱反应5 min，转至65 ℃恒温水浴箱5 min 使酶失活，酶切结果用2%琼脂糖凝胶水平电泳后采用G:BOX 凝胶成像系统鉴定。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 16.0 统计软件进行分析，样本分布经Hardy-Weinberg 平衡检验，检验样本群体代表性;计数资料用百分比表示，病例组和对照组的基因型及等位基因频率分布的差异用χ2检验分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-17A 基因-152G/A 位点

PCR 扩增产物结果显示哮喘组和对照组均扩增出344 bp 目的片段，见图1。哮喘组和对照组PCR 扩增产物经PdmⅠ酶切后均发现AA、AG、GG3 种基因型，AA 基因型为213 bp、131 bp，AG 基因型为344 bp、213 bp、131 bp，GG 基因型为344 bp。见图2。

图1 哮喘组和对照组IL-17A-152G/A位点PCR 扩增产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis of PCR products of the-152G/A site of IL-17A gene

图2 IL-17A 基因-152G/A 位点不同基因型PCR 产物酶切电泳结果Fig.2 Enzyme digestion electrophoresis of PCR products of different genotypes of IL-17A gene-152G/A site

2.2 IL-17A 基因-152G/A 位点基因型及等位基因频率分布

哮喘组和对照组经Hardy-Weinberg 平衡检测示均具有群体代表性(表1)，在性别、年龄上差异均无统计学意义(χ2=1.364，t =1.388，P ＞0.05)。两组间基因型频率分布差异有统计学意义(χ2=7.832，P =0.020)，经χ2分割检验，AA 基因型与AG 基因型频率分布差异有统计学意义(χ2=4.395，P=0.036，OR=1.929，95%CI=1.038 ～3.588)，AA 基因型与GG 基因型频率分布差异亦有统计学意义(χ2=7.826，P=0.005，OR=2.571，95%CI=1.315 ～5.029)，AG 基因型与GG基因型频率分布差异无统计学意义(χ2=1.426，P=0.232);两组间等位基因频率分布差异有统计学意义(χ2=6.635，P =0.01，OR=1.477，95%CI=1.097 ～1.988);变异等位基因A 与哮喘关联，A 基因携带者患哮喘的风险高于非携带者，尤以突变纯合子AA 为著。见表1。

表1 哮喘组和对照组被检儿童IL-17A 基因-152G/A 位点基因型及等位基因分布Tab.1 Characteristics of the genotype and allele frequencies of IL-17A gene-152G/A site of children in asthma group and control group

3 讨论

Th17 细胞是Park 于2005 年在对两种自身免疫疾病动物模型，实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、胶原诱导性关节炎(CIA)的研究过程中发现的一类不同于Th1 和Th2 的CD4+Th 亚群细胞［5］，可以诱导组织发生强烈炎症反应的T 细胞亚群［6］，可以通过多种途径参与哮喘的发生发展，其效应因子IL-17 与哮喘等疾病明显相关［7］。IL-17 通过促进树突状细胞的成熟，刺激相关细胞产生一系列炎性介质和趋化细胞因子等，导致炎症反应的发生［8］，活化的IL-17 还可激活上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞，释放粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、IL-1、IL-6 和IL-8 等，不仅促进气道炎症的进一步加剧，还能参与气道的重构。气道重塑病理基础包括气道上皮细胞和平滑肌增生，粘液高度分泌，上皮下组织纤维化，以及血管生成［9］。

研究表明，IL-17A 基因的单核苷酸多态性与多种疾病相关，尤其是自身免疫性疾病［10］。一项日本研究报道，rs2275913 位点(-152G/A)位于IL-17A 启动子区域，可调控IL-17 表达，A 等位基因可增强启动子活性并增强启动子与核转录因子活化T 淋巴细胞核因子的结合能力，促进IL-17 表达［11］。基因内部的单核苷酸多态性直接或间接影响蛋白质表达水平或性质，从而导致遗传易感性。

Nordang 等［12］对挪威和新西兰的高加索人进行研究，发现在IL-17A 的5 个SNP 多态性基因位点中rs2275913 与挪威人类风湿性关节炎的发生有关，而与新西兰的高加索人类风湿性关节炎却没有明显相关性。Arisawa 等［13］对日本UC 患者IL-17A/F 基因多态性的分析中认为，rs2275913 和rs763780 的基因多态性均与UC 的患病相关。

本研究结果示哮喘组及对照组均存在野生型(GG)、杂合子型(AG)及突变型(AA)三种基因型，基因型及等位基因频率在两组间差异均有统计学意义，发现IL-17A 基因-152G/A 位点多态性与贵阳地区儿童哮喘发病存在相关性，A 等位基因频率显著高于对照组，可能增加儿童患哮喘的风险，当G 突变为A 时，患哮喘的风险是健康儿童的1.477倍，尤其以突变纯合子AA 基因型较其他基因型更易患哮喘，为其它基因型的2.134 倍(χ2=6.376，P =0.012，OR=2.134，95%CI=1.174 ～3.877);Chen J 等［3］对IL-17A rs2275913 位点基因型频率检测中发现该位点和哮喘相关，纯合子A 的儿童患哮喘的几率是其他基因型的2.29 倍，这与本实验结果一致。但Wang 等［14］对台湾地区汉族哮喘儿童IL-17A 基因多个多态性位点的研究中发现－152A/G 位点与该地区哮喘发病无关;王娟等［15］研究发现IL-17A 基因rs711998 可能是儿童哮喘易感位点，其中该位点GG 纯合子基因型与哮喘发病密切相关，未发现IL-17A rs2275913 多态性与哮喘发病有相关性，这与本实验结果不同。哮喘是一种复杂的多基因遗传倾向的疾病，人体中基因与基因之间有着相互作用及累积效应，环境因素，在儿童中如被动吸烟、空气中的尘螨、宠物毛屑等均可影响哮喘的易感性，这些均可造成实验结果的差异。

综上所诉，IL-17A 基因-152G/A 位点可能是贵阳地区儿童哮喘的候选基因，目前指南推荐的吸入性激素(ICS)治疗虽能有效控制嗜酸性粒细胞介导的气道炎症，但对中性粒细胞炎症及气道重塑无效，IL-17 作为促进哮喘中性粒细胞炎症的重要因子，与哮喘气道重塑关系密切，有望成为防治哮喘的新靶点。进行哮喘易感基因的多态性的检测，希望能早期从基因水平筛选哮喘易感人群，以便早期诊断、干预及治疗。

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