抗人大细胞肺癌单抗用于肺癌检测的价值研究

张趁华，蔡家利

（1莆田学院 基础医学部，福建 莆田351100；2重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆400054）

单克隆抗体在生物学和医学研究领域具有很大的应用价值，可直接用于人类疾病的诊断、机体免疫机制的研究以及实验室科学研究等，尤其可为人类恶性肿瘤的免疫诊断提供较为可靠的辅助指标［1－2］。

在世界范围内肺癌的发病率和死亡率逐年上升，但肺癌的诊断技术并未十分完善，临床上常用的X线检查、支气管镜检查、ECT检查等不仅耗时耗力，而且确诊率不高。近些年免疫检测成为癌症诊断的研究热点。免疫组化检测以简易、快捷、通用、灵敏、重现性好、经济的特点在疾病免疫检测方法中占有重要的地位。将肺癌单克隆抗体用于肺癌免疫组化检测中，将为肺癌的诊断提供较为可靠的辅助指标［3－4］。

目前，国内外临床诊断中还没有一种针对大细胞肺癌的有效诊断试剂，常用的血清p53抗体检测、癌胚抗原（CEA）检测、神经元特异性烯醇化酶（NSE）检测、细胞角蛋白片段（CYFRA21－1）检测等，特异性均不理想，本文所制备的抗大细胞肺癌单克隆抗体正好能解决这一问题。其可广泛用于临床大细胞肺癌的检测诊断中。

1 材料和方法

1.1 材料

弗氏不完全佐剂（Freund′s Incompleted Adjuvant，FIA，北京鼎国生物技术有限公司），6～8周龄Balb／C小鼠（重庆医科大学实验动物中心），羊抗鼠IgG－HRP（北京鼎国生物技术有限公司），其他试剂为国产分析纯，大细胞肺癌NCIH460细胞株、小细胞肺癌A549细胞株和抗人大细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞株（重庆理工大学生物制药实验室保存），DMEM培养基（GiBCO公司）。

1.2 方法

1.2.1 大细胞肺癌NCIH460细胞株、小细胞肺癌A549细胞株和抗大细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞株的培养 用含10%小牛血清的DMEM培养基对大细胞肺癌NCIH460细胞株、小细胞肺癌A549细胞株和抗大细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养，并在液氮中冻存数支［5－6］。

1.2.2 抗人大细胞肺癌单克隆抗体的制备和纯化鉴定 用弗氏不完全佐剂免疫Balb／C小鼠，3～5 d后，腹腔注射抗人大细胞肺癌杂交瘤细胞1～5×106个／只，接种细胞10～12d后出现腹水，12号针头插入腹腔引流收集小鼠腹水持续数日。收集到的腹水采用辛酸－硫酸铵法纯化。纯化方法如下：2 500r／min离心腹水弃杂质，加入等体积的0.06 mol／L，pH 4.0NaAc－HAc缓冲液，调pH 至4.8；加入1／33体积的辛酸，室温搅拌≥30min，4℃搅拌≥60min，逐滴加完，4℃澄清2h；4℃，15 000 r／min离心30min，去除白蛋白和其他非IgG蛋白，上清加入1／10体积的10×PBS（0.01mol／L，pH 7.4），调 pH 至 7.2；上清滴加等量饱和硫酸铵（pH 7.2～7.4）溶液，使硫酸铵的饱和度为50%，继续搅拌10～30min，静置30min；4℃，10 000r／min离心30min，弃上清，将沉淀溶于1.2mL，0.01 mol／L，pH 7.4PBS 中；4℃，0.01mol／L，pH 7.4 PBS透析过夜，其间换液3次，收集透析袋内液体，即为纯化后的腹水单抗，－20℃冻存备用并取少量用于 SDS－PAGE分析纯化纯度［7－9］。

1.2.3 抗大细胞肺癌单抗对培养的肺癌细胞的特异性检测

（1）细胞爬片的制备：将处于对数生长期的大细胞肺癌NCIH460细胞和小细胞肺癌A549细胞的浓度分别调至3×106个／mL，将细胞悬液滴至灭菌玻片上，以铺满玻片为准，放置5%CO2培养箱中培养36～48h后，用丙酮固定细胞爬片20min后，放置于－20℃备用。

（2）免疫组化法鉴定细胞爬片：采用间接免疫组化检测法。在细胞爬片上滴加3%H2O2／甲醇溶液，室温，10min，用于祛除细胞内源性过氧化物酶；封闭液1%BSA封闭细胞爬片，37℃，20min；一抗为稀释度为1∶200的抗大细胞肺癌单抗，37℃，1 h；二抗为稀释度为1∶400的HRP－羊抗鼠IgG，37℃，30min；显色液DAB显色10～30s后，苏木素复染，显微镜下观察。阳性对照为大细胞肺癌NCIH460细胞爬片，阴性对照为小细胞肺癌A549细胞爬片［10－11］。

1.2.4 抗大细胞肺癌单抗对临床样品的特异性检测

（1）石蜡病理切片的预处理：大细胞肺癌石蜡病理切片和小细胞肺癌石蜡病理切片均购于重庆医科大学附属医院。大细胞肺癌患者两例，入院时症状均表现为咳嗽，痰中带血，胸痛，呼吸困难，头面部及上臂水肿，颈部淋巴结肿大，病理标本一例为胸腔镜检查所获，一例为纤维支气管镜检查所获；小细胞肺癌患者一例，入院时症状表现为咳嗽，胸闷，气短，头晕，吞咽困难，病理标本为纤维支气管镜检查所获。

将石蜡病理切片放置于65℃的恒温箱中进行烤片，2h；二甲苯脱蜡，15min；无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇梯度脱水，每次5min；微波修复抗原后备用［12－14］。

（2）免疫组化法鉴定石蜡病理切片：采用间接免疫组化检测法，方法同1.2.4（2）。阳性对照为大细胞肺癌石蜡病理切片，阴性对照为小细胞肺癌石蜡病理切片。

2 结果

2.1 抗大细胞肺癌单克隆抗体纯化结果

采用辛酸－硫酸铵法纯化抗大细胞肺癌小鼠单抗腹水，如图1（a为中分子量蛋白 Marker，b为未纯化的腹水，c为纯化后的腹水）所示，小鼠腹水中的杂蛋白已基本除去，抗大细胞肺癌单克隆抗体其纯度可达到90%以上。

图1 抗人大细胞肺癌单克隆抗体纯化前后的SDS－PAGE分析Fig.1 The SDS－PAGE mobility pattern of lung cancer monoclonal antibody befor and after purificationa.中分子量蛋白 Marker；b.未纯化的腹水；c.纯化后的腹水。

2.2 抗大细胞肺癌单抗对培养的肺癌细胞的特异性检测结果

图2 大细胞肺癌NCIH460细胞爬片的免疫组化检测结果（×100）Fig.2 The micrographs of the big cell lung cancer NCIH460 cell by immunohistochemistry（×100）大细胞肺癌细胞细胞核染为蓝色，细胞内与单抗特异性结合的抗原蛋白被染为黄色。

图3 小细胞肺癌A549细胞爬片的免疫组化检测结果（×100）Fig.3 The micrographs of the small cell lung cancer A549cell by immunohistochemistry（×100）小细胞肺癌细胞细胞核染为蓝色，细胞质内蛋白均无着色。

抗大细胞肺癌单抗应用于间接免疫组化检测法检测大细胞肺癌细胞爬片和小细胞肺癌细胞爬片，检测结果如图2、图3所示，抗大细胞肺癌单抗能特异性地识别出大细胞肺癌细胞，染色液苏木素将细胞核染为蓝色作为背景色，DAB显色液将大细胞肺癌细胞中与抗大细胞肺癌单抗特异性结合的抗原蛋白染为黄色，能显微镜下清晰地辨认；小细胞肺癌细胞中除被苏木素染为蓝色的细胞核外其他则无任何显色反应。

2.3 抗大细胞肺癌单抗对临床样品的特异性检测结果

大细胞肺癌病理切片和小细胞肺癌病理切片均购于重庆医科大学附属医院。其中，大细胞肺癌病理切片标本两例，一例来源于65周岁的男性晚期大细胞肺癌病人，取癌肿组织及癌旁2cm处组织为标本，一例来源于71周岁的男性晚期大细胞肺癌病人，取癌肿组织及癌旁2cm处组织为标本；小细胞肺癌病理切片标本一例，来源于62周岁的男性晚期小细胞肺癌病人，取癌肿组织及癌旁2cm处组织为标本。

图4 大细胞肺癌石蜡病理切片免疫组化检测结果（×100）Fig.4 The micrographs of the big cell lung cancer tissue by immunohistochemistry（×100）石蜡切片中细胞的细胞核均被染为蓝色，只有大细胞肺癌细胞中与单抗特异性结果的抗原蛋白被染为黄色，其他细胞质内蛋白均无色。

图5 小细胞肺癌石蜡病理切片免疫组化检测结果Fig.5 The micrographs of the small cell lung cancer tissue by immunohistochemistry石蜡切片中细胞的细胞核均被染为蓝色，细胞质内的蛋白均无色。

大细胞肺癌单抗应用于间接免疫组化检测法检测大细胞肺癌石蜡病理切片和小细胞肺癌石蜡病理切片，检测结果如图4、图5所示，染色液苏木素将细胞核染为蓝色作为背景色，抗大细胞肺癌单抗能特异性地识别出石蜡病理切片中的大细胞肺癌细胞，DAB显色液将大细胞肺癌细胞中与抗大细胞肺癌单抗特异性结合的抗原蛋白染为黄色，其他细胞细胞质内的蛋白均未着色，能在显微镜下清晰地辨认；小细胞肺癌石蜡病理切片中的细胞除被苏木素染为蓝色的细胞核外，其他均无任何显色反应。

3 讨论

肺癌是世界范围内常见的一种恶性肿瘤，近些年随着生存环境的恶化、空气污染的加剧等因素，肺癌的发病率和死亡率也在逐年升高。虽然传统检测肺癌的方法如X线检查、支气管镜检查、ECT检查等技术也在不断地发展中，但这些技术需要精密检测仪器的支持和医生常年积累的检测和诊断经验，而且确诊率也不高。在过去十多年中，由于基因、免疫学及分子生物学领域中取得的进展已使肺癌的确诊成为可能，尤其是肺癌诊断试剂的研制使肺癌的快速、简便、有效诊断成为可能［15－16］。

本文所制备的抗大细胞肺癌单克隆抗体特异性强、敏感度高，能选择性地结合大细胞肺癌细胞质的抗原蛋白，而不与其他蛋白结合。将抗大细胞肺癌单克隆抗体应用于免疫组化检测中，在显微镜下即可观察检测结果，方便、快捷、耗时短、重现性好、确诊率高，无须特殊仪器设备和专业技能，为肺癌患者的诊断提供可靠的辅助性指标，可广泛用于临床大细胞肺癌的检测诊断中，具有良好的市场应用前景［17］。

4 结论

本文制备的大细胞肺癌单克隆抗体通过小鼠腹水扩增并采用辛酸－硫酸铵法纯化，纯度可达到90%以上；应用大细胞肺癌单克隆抗体对培养的肺癌细胞和临床样本通过免疫组化法进行特异性检测，结果均显示大细胞肺癌单克隆抗体可特异性地与大细胞肺癌细胞内的抗原蛋白结合，在显微镜下及可观察检测结果，可为大细胞肺癌的诊断提供可靠的辅助性指标。

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