67KDa层粘连蛋白在小胶质细胞上的存在及EGCG对其影响的研究＊

陕西省人民医院神经内三科（西安710068）

陈 丽 郭兴志 种 莉 任雪芝 刘 玥 刘 鹏 唐 鹏 李晓青 李 锐△

过度活化的小胶质细胞与神经变性疾病关系密切，前期研究表明：绿茶的一种多酚类单体－表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）具有强大的抑制小胶质细胞活化效应［1］。神经变性疾病是危害中老年人群的疾病，包括阿尔茨海默病及帕金森病等，随着人们对神经变性疾病认识加深，小胶质细胞的活化释放炎症因子在神经变性疾病的各个环节备受关注［2］。有研究显示：在阿尔茨海默病患者的脑中活化的小胶质细胞与β淀粉样蛋白的沉积相随［3］。Daisuke等研究表明：67KDa层粘连蛋白（67KDa laminin receptor，67LR）存在于肿瘤细胞膜表面且EGCG作为一种抗癌药物可抑制67LR的活性［4］。本研究应用免疫荧光细胞双标染色及Western blot半定量观察小胶质细胞上是否存在67LR，以及给予干预后67LR的表达量的变化，旨在为神经变性疾病提供新的思路。

材料与方法

1 实验材料 24～48h的Spraque Dawley（SD）新生大鼠由西安交通大学验动物中心提供；低糖DMEM培养基，胎牛血清，0.25%胰酶，0.25% ／0.02%EDTA胰酶，购于 HyClone公司；小鼠抗大鼠CD11b抗体购于Millipore公司；兔抗大鼠67LR抗体购于Abcam公司；山羊抗小鼠荧光二抗（PE），山羊抗兔荧光二抗（FITC），山羊抗兔（HRP）二抗，B－actin内参购于北京博奥森公司，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、EGCG购自美国Sigma公司；山羊封闭血清购于Sigma公司；DAB显色液购于博奥森公司。预染蛋白Mark，BCA蛋白定量盒，蛋白裂解液RIPA，蛋白酶抑制剂均购于碧云天公司。

2 实验方法

2.1 神经细胞－小胶质细胞混合培养，LPS刺激观察细胞变化：SD大鼠，剪碎大脑皮质后胰酶消化，接种于培养瓶中，加入10%胎牛血清及DMEM，培养箱37℃中培养，当细胞完全汇合后，分为对照组，LPS组，EGCG＋LPS组，24h后使用温和消化法［5］分离纯化小胶质细胞，特异性抗体CD11b鉴定细胞纯度，分别进行免疫荧光细胞双标及 Western blot。

2.2 免疫荧光细胞双标证明67LR存在小胶质细胞上，并观察小胶质细胞的变化及67LR表达的变化：分离纯化小胶质细胞后，4%多聚甲醛固定30min，用山羊血清封闭液进行封闭，加入特异性抗体CD11b，特异性抗体67LR，4℃冰箱过夜，加入荧光二抗PE和荧光二抗FITC，室温下40min，甘油封片后荧光显微镜下观察小胶质细胞数目及形态学改变及67LR的表达。

2.3 Western blot半定量观察67LR的表达量的变化：将培养分离纯化的小胶质细胞加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取膜蛋白，BCA蛋白定量法定量蛋白浓度，加入40μg上样，加缓冲液电泳。转膜，在室温下摇床2h，加入67LR一抗，4℃冰箱过夜。加入HRP二抗。孵育1h后DAB显色，用β－actin做内参对照。

3 统计学方法 测定结果用图像处理软件，用SPSS17.0分析处理。

结 果

1 LPS刺激对混合培养小胶质细胞数量的影响每瓶（75cm2）神经元／小胶质细胞静息状态可得到（4.05±0.30）×106个细胞；而LPS刺激后可获得（16±0.15）×106个细胞，为前者的3.95倍。

2 小胶质细胞67LR不同状态的变化 见附图。在静息状态下的小胶质细胞数量较少，CD11b、67LR、CD11b／67LR双标显示细胞胞体细小且呈分枝状、67LR的表达较少；给予LPS刺激后的小胶质细胞数量较静息时明显增多，双标显示细胞胞体变大，呈阿米巴样，67LR的总量增加，提示LPS刺激后小胶质细胞的数量增多，形态改变；另一组提前半小时给予EGCG干预后细胞数量明显减少，胞体呈分枝状，67LR的总量减少，提示EGCG有抑制小胶质细胞活化作用。

3 小胶质细胞67LR表达变化的免疫印迹分析Western blot半定量观察小胶质细胞上的67LR的表达量的变化，67LR行密度扫描半定量分析显示：给予LPS刺激后小胶质细胞67LR是β－actin1.8±0.52倍；提前加入0.5μM EGCG后67LR的表达是β－actin1.25±0.5倍；加入5μM EGCG后67LR的表达是β－actin的0.91倍，提示EGCG对小胶质细胞上的67LR具有抑制作用。

讨 论

小胶质细胞约占胶质细胞的10%左右，广泛存在于中枢神经系统，小胶质细胞的存在方式有静息和活化两种状态，并且易受微环境影响而从静息状态转为活化状态，这是小胶质细胞的特性之一［6］。在正常情况下，小胶质细胞呈分支状或杆状，对神经元起着重要的支持、修复作用，在神经系统神经系统中扮演重要角色［7］。而当中枢神经系统遭受感染、外伤等，静息的小胶质细胞迅速被激活，形态发生改变，表面的突起，增粗，由分枝状的转变成阿米巴样巨噬细胞，同时释放各种炎症因子，并出现增殖、趋化吞噬等功能［8］。Aβ沉积是AD神经炎性老年斑的重要病理特征，如前所述在阿尔茨海默病患者的脑中活化的小胶质细胞与β淀粉样蛋白的沉积相随［3］，因此小胶质细胞在AD的病理改变具有极其重要的地位，所以抑制小胶质细胞过度活化，减少炎性因子的释放，成为改善AD发生的新策略。67LR已经被证明存在于许多种肿瘤细胞膜上。有研究显示：小胶质细胞与神经元混合培养，加入外源性层粘连蛋白（LPS）后激活小胶质细胞的同时还可损伤神经元，提示67LR对小胶质细胞介导的神经元死亡具有重要意义［9，10］。前期研究表明：EGCG对小胶质细胞的活化反应有直接的抑制作用［1］，本实验通神经细胞－小胶质细胞混合培养，观察静息状态小胶质细胞的形态，给予LPS这一强大的小胶质细胞活化剂，小胶质细胞由静息变为活化状态后数量及形态变化，通过特异性抗体67LR免疫荧光标记确证小胶质细胞膜上存在67LR及67LR的表达增加，给予EGCG干预后小胶质细胞的形态、数量及67LR的表达减少，进一步用Western blot半定量观察67LR的表达量的变化，提示67LR在小胶质细胞的活化中扮演重要角色，可能介导了EGCG的药理学作用。本研究结果为神经变性疾病治疗提供重要的理论基础。

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