UPLC-MS／MS法测定3种兽药制剂中违禁药物氯丙嗪

李波平，花锦，李涵，陈谷峰，刘能盛，肖前，李丹，赵泉，单利君

（1.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广州510623；2.山西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，太原030024；3.暨南大学包装工程研究所，广东珠海519000）

UPLC-MS／MS法测定3种兽药制剂中违禁药物氯丙嗪

李波平1，花锦2，李涵1，陈谷峰1，刘能盛1，肖前1，李丹1，赵泉1，单利君3

（1.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广州510623；2.山西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，太原030024；3.暨南大学包装工程研究所，广东珠海519000）

建立了3种兽药制剂中违禁药物氯丙嗪的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS／MS）检测方法。用无水乙醇超声提取试样中违禁药物氯丙嗪，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），乙腈和10 mmol／L乙酸铵+0.1%甲酸溶液流动相，梯度洗脱，电离喷雾电离方式（ESI+），多反应监测（MRM）定量。该方法线性关系良好，相关系数r2达到0.9956，回收率在88.3%～96.7%之间，相对标准偏差（RSD）介于3.7%～8.1%。方法的检出限为0.003 mg／kg。本方法适用于兽药制剂中氯丙嗪违法添加的定性、定量分析。

兽药制剂；氯丙嗪；违禁药物；超高效液相色谱-串联质谱

氯丙嗪是吩噻嗪类代表药物，又名冬眠灵，是常见的安眠、镇静、催眠药物，为中枢多巴胺受体的阻断剂，作用于中枢神经系统，兽医临床上主要被用作镇静药［1］。饲料中添加此类药物可间接起到催肥作用；使用吩噻嗪类药物可降低动物运输过程中的死亡率［2］，因此一些不法分子受利益所趋经常使用添加氯丙嗪的兽药。残留的药物通过动物食品进入人体，并经长期蓄积后引起中毒，大剂量时可引起人体肝脏、肾脏的病变，甚至危害生命健康。为此，我国农业部在176号和235号公告中明确禁止在动物饲料中使用氯丙嗪，在动物源食品中不得检出［3-4］；农业部第193号公告中，氯丙嗪被明确禁止在兽药中使用。在进出口贸易中，氯丙嗪已被列入禁用类药物，国家规定不得检出，日本肯定列表中也明确表示氯丙嗪不得检出［5］。欧盟早已将氯丙嗪列入禁用清单中［6］。目前，国内外关于氯丙嗪检测的研究涉及饲料［4］、猪肉［1，7］、猪肝［8-9］等动物性食品［3，6］、血液［10］、蛋白［11］、血浆和生物组织［12-14］、尿液［15］等，以生物体内残留检测为主。关于氯丙嗪的检测方法，有气质联用［1，9］、液相色谱［7，11，13］、液质联用［4，6，10］、化学发光［16］等，国内外尚未有测定兽药制剂中氯丙嗪的文献报道。GC和GC-MS对药物的分析需要进行衍生化，耗时较长。LC-MS／MS灵敏度高，选择性和特异性好［4］，在检测领域得到越来越广泛的应用。本研究采用乙醇超声提取，建立了UPLC-MS／MS法测定兽药制剂中违禁药物氯丙嗪。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪（美国，Waters公司），Premier串联四极杆质谱仪（美国，Waters公司），HA-180M型电子天平，0.0001 g（日本A＆D公司）；移液器（德国Eppendorf股份公司）：0.2～0.5 mL，1～5 mL，10～100 mL，100～1000 mL；离心机HC-3518（杭州华创科学器材有限公司），涡旋混合器TALBOYS Advanced Vortex Mixer（杭州华创科学器材有限公司），超声波KQ-500DB型（昆山超声仪器有限公司），Mili-Q净化水系统（法国进口），滤膜：0.22 μm（美国Waters公司）。

1.2 药品与试剂

1.2.1 对照品 氯丙嗪标准品，纯度99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2.2 供试品

1.2.2.1 阴性对照兽药制剂 喹氟宁（粉末）、替米考星（液体）、心肝包治（恩诺沙星可溶性粉），市售，以上三种兽药制剂经检测均不含氯丙嗪。

1.2.2.2 阳性添加兽药制剂 分别按0.01、0.02、0.1 mg／kg的比例在阴性对照兽药制剂中添加氯丙嗪标准物质，混匀。

1.2.2.3 试剂 色谱纯乙腈（美国，Fisher公司），无水乙醇（分析纯），超纯水。

1.2.2.4 标准溶液配制 准确称取氯丙嗪标准品10.0 mg，用乙腈溶解并准确定容到10 mL，配制成浓度为1000 mg／L的标准储备液。该溶液可在0～4℃冰箱中保存12个月。使用时稀释成所需浓度。

1.3 测定方法

1.3.1 质谱分析条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈／10 mmol／L乙酸铵+0.1%甲酸，梯度洗脱；柱温35℃；流速0.3 mL／min；进样量10 μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序表

质谱条件如下。电离方式：电喷雾电离（ESI）；扫描方式：正离子扫描；离子源温度120℃；脱溶剂气温度380℃；毛细管电压：3.0 kV；锥孔气流：氮气，流速50 L／h；去溶剂气流：氮气，流速700 L／h；碰撞气：氩气，碰撞气压3.5×10-3mbar；检测方式：多反应监测（MRM）。监测条件参见表2。

表2 离子对、锥孔电压、碰撞能量表

1.3.2 标准曲线绘制 精密量取标准储备液，用乙腈稀释为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg／L的系列标准溶液，用1.3.1项的质谱条件分析，记录色谱图。

1.3.3 样品前处理 准确称取（2±0.05）g固体或液体样品，置10 mL具塞锥形瓶中，精密移取4 mL无水乙醇摇匀，2800 r／min涡旋3 min，100 W功率下超声提取10 min，静置，经0.22 μm滤膜过滤，收集约1 mL至进样瓶，进行UPLC-MS／MS分析。

1.3.4 样品回收率与精密度 准确称取2.0 g喹氟宁（粉末）、替米考星（液体）、心肝包治（恩诺沙星可溶性粉）于10 mL锥形瓶中，分别添加浓度为0.5 mg／L的氯丙嗪标准溶液0.04、0.08、0.4 mL至样品中，制得添加水平分别为0.01（LOQ）、0.02（2LOQ）、0.1（10LOQ）mg／kg的样品。按照本方法确定的条件进行加标回收重复性试验，每个浓度测定6次，计算回收率及相对标准偏差。

1.3.5 检测限和定量限 取空白样品，按上述步骤操作，测得噪音信号的平均值，按信噪比（S／N≥3）测得方法的检出限（LOD），按信噪比（S／N）≥10测得方法的定量限（LOQ）。

2 结果

2.1 色谱图 采用1.3项的方法测定，待测物质出峰时间为3.11 min，出峰时间短，峰形良好。三种兽药制剂均未检出氯丙嗪。在此仅以喹氟宁为例列图说明。氯丙嗪标准溶液、兽药制剂喹氟宁空白样品、兽药制剂喹氟宁添加氯丙嗪（0.02 mg／kg）样品的色谱图分别见图1、图2、图3。

图1 氯丙嗪标准溶液（0.05 mg／L）MRM图

图2 兽药制剂喹氟宁空白样品MRM图

图3 兽药制剂喹氟宁中添加氯丙嗪（0.02 mg／kg）MRM图

2.2 标准曲线 用1.3.1项条件测定1.3.2标准系列溶液，以峰面积为Y轴，对相应的浓度（mg／L）为X轴绘制标准曲线，得到线性方程为：Y＝30353X-162.96，相关系数r2＝0.9956，线性关系良好。

2.3 方法的回收率与精密度 按照本方法的条件进行加标回收试验，每个浓度水平进行6次重复测定，统计结果见表3。结果表明，三种兽药制剂的添加平均回收率在88.3%～96.7%之间，RSD介于3.7%～8.1%。

2.4 检出限 通过空白样品加标的方法测定，方法的检出限（LOD）为0.003 mg／kg，方法的定量限（LOQ）为0.01 mg／kg。

表3 氯丙嗪在兽药制剂中的加标回收率及变异系数表

3 讨论与小结

3.1 提取溶剂的选择 根据兽药典（2000版），氯丙嗪易溶于水、乙醇和氯仿，不溶于乙醚和苯。本文考虑氯仿的毒性较大，且与反相液相色谱流动相的兼容性较差，故排除氯仿。本研究以加标回收率为指标分别比较了水、乙醇、水∶乙醇（1∶1）的提取效果，对添加氯丙嗪浓度为0.01 mg／kg的空白心肝包治进行测定，结果表明，当使用乙醇作为提取剂时目标物回收率最高，因此选用乙醇作为提取溶剂。

3.2 色谱柱及流动相的选择 根据文献［4，10］及实验室现有条件，选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，试验结果表明，采用该柱出峰时间短，与杂峰分离较好。文献［4］提出流动相中加入0.1%甲酸，可降低流动相的pH值，有助于化合物的离子化，可以提高灵敏度。文献［6］提出在流动相中加入一定比例的铵盐，可以使药物易于出峰，改善峰形。乙酸铵是理想的流动相，可有效抑制拖尾，增强电离作用。乙腈和甲醇是液相色谱质谱常用的流动相。综合以上所述，本研究比较了乙腈／10 mmol／L乙酸铵+0.1%甲酸、乙腈／10 mmol／L乙酸铵、乙腈／0.1%甲酸、甲醇／10 mmol／L乙酸铵+0.1%甲酸、甲醇／10 mmol／L乙酸铵、甲醇／0.1%甲酸作为流动相的分离效果。结果表明，选用乙腈／10 mmol／L乙酸铵+0.1%甲酸为流动相，目标化合物的响应较高，离子化效果好，最终选用乙腈／10 mmol／L乙酸铵+0.1%甲酸为流动相。

3.3 质谱条件的优化 根据氯丙嗪物质的结构特征，并参考文献［2-3，10］选择多反应监测方式（MRM）、电喷雾离子源（ESI）进行采集，在正离子扫描模式下进行一级质谱分析，可观察到氯丙嗪的［M+H］+分子离子峰，确定氯丙嗪的准分子离子［M+H］+m／z为319.40。在对准分子离子进行二级质谱扫描时，又得到稳定的碎片离子。进一步对质谱参数锥孔电压和碰撞电压进行优化，最终确定表2中的质谱条件。

本方法为超高效液相色谱串联质谱-电喷雾正离子测定3种兽药制剂中氯丙嗪，该方法操作简单、分析时间短、回收率高，填补了兽药制剂中氯丙嗪检测的空白，为检测兽药制剂中非法添加氯丙嗪提供了有效的技术支持。

［1］ 单美娜，徐晓枫，蒲云霞，等.气相色谱质谱法测定猪肉中氯丙嗪残留［J］.中国食品卫生杂志，2013，25（5）：438-440.

［2］ 齐士林，吴敏，严丽娟，等.超高效液相色谱-质谱对动物源食品中氯丙嗪、异丙嗪及其代谢物的测定［J］.分析测试学报，2009，28（6）：677-681.

［3］ 渠岩，路勇，冯楠，等.基质固相分散-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定畜禽肉中残留的13中镇静药物［J］.食品科学，2012，33（8）：252-255.

［4］ 许成保，锁然，张峰，等.超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱快速检测动物饲料中10种违禁精神药物［J］.色谱，2012，5（30）：457-462.

［5］ 洪月玲，郝学飞，董柯，等.动物性食品中氯丙嗪残留的液相色谱法检测［J］.食品科学，2009，30（14）：269-271.

［6］ 李丹妮，黄士新，张文刚，等.超高效液相色谱—串联质谱法检测六种动物组织中盐酸氯丙嗪残留［J］.中国兽药杂志，2010，44（2）：7-11.

［7］ 李堃，赵丹莹，郭蒙京.猪肉中氯丙嗪含量的高效液相色谱测定法［J］.职业与健康，2013，29（2）：181-183.

［8］ 李品艾，张会芬，张玲.UPLC法同时测定猪肝中五种磺胺类药物与氯丙嗪残留量［J］.医学检验，2010，17（20）：77-78.

［9］ 吕燕，杨挺，赵健，等.气相色谱-质谱法测定猪肝中氯丙嗪残留量［J］.分析试验室，2008，27（3）：119-122.

［10］董颖，杜鸿雁，邵永军.UPLC-MS／MS测定全血中的氯丙嗪［J］.中国法医学杂志，2013，28（1）：44-46.

［11］Jessica J.W.Broeders，Bas J.Blaauboer，Joop L.M.Hermens.Development of a negligible depletion-solid phase microextraction method to determine the free concentration of chlorpromazine in aqueous samples containing albumin［J］.Chromatography A，2011，1218：8529-8535.

［12］Guodong Zhang，Alvin V.Terry Jr.Michael G.Bartlett.Sensitive liquid chromatography／tandem mass spectrometry method for the determination of the lipophilic antipsychotic drug chlorpromazine in rat plasma and brain tissue［J］.Chromatography B，2007，（854）：68-76.

［13］Yadollah Yamini，Mohammad Faraji.Extraction and determination of trace amounts of chlorpromazine in biological fluids using magnetic solid phase extraction followed by HPLC［J］.Pharmaceutical Analysis，2014，4（4）：279-285.

［14］Hamid Reza Sobhi，Yadollah Yamini，Reza Haji Hosseini Baghdad Abadi.Extraction and determination of trace amounts of chlor⁃promazine in biological fluids using hollow fiber liquid phase microextraction followed by high-performance liquid chromatography［J］.Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007，（45）：769-774.

［15］Jing CHEN，Chaomei XIONG，Jinlan RUAN.Dispersive Liquidliquid Microextraction Combined with High-performance Liquid ChromatographyfortheDeterminationofClozapineand Chlorpromazine in Urine［J］.Huazhong Univ Sci Technol［Med Sci］，2011，31（2）：277-284.

［16］李旭菲，杨燕英，周考文.毛细管电泳电致化学发光法同时测定氯丙嗪、异丙嗪及其主要代谢物［J］.色谱，2012，30（9）：938-942.

（编辑：侯向辉）

Determination of Chlorpromazine Illegally Added in 3 Kinds of Veterinary Preparations by UPLC-MS／MS

LI Bo-ping1，HUA Jin2，LI Han1，CHEN Gu-feng1，LIU Neng-sheng1，XIAO Qian1，LI Dan1，ZHAO Quan1，SHAN Li-jun3
（1.Guangdong Exit／Entry Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou 510623，China；2.Shanxi Exit／Entry Inspection and Quarantine Bureau，Taiyuan 030024，China；3.Packaging Engineering Institute of Jinan University，Guangdong，Zhuhai 519000，China）

A method of determination of chlorpromazine illegally added in 3 kinds of veterinary preparations by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS／MS）was developed.Chlorpromazine was extracted with ethanol by ultrasonic wave and separated on the Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column（50 mm×2.1 mm，1.7μm）using the mobile phase of acetonitrile／mixture of 10 mmol／L ammonium acetate and 0.1%formic acid with gradient elution.Chlorpromazine was detected in electrospray ionization（ESI+）mode using multiple reaction monitoring（MRM）.There was a good linear relationship with the correlation rate more than 0.9956.The average recoveries ranged from 88.3%to 96.7%.The standard deviation was between 3.7%and 8.1%.The limit of detection was 0.003 mg／kg.The method was rapid，simple，sensitive and accurate.It was suitable for qualitative and quantitative analysis of the illicit drug chlorpromazine in veterinary preparations.

veterinary preparations；chlorpromazine；illicit drug；ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry（UPLC-MS／MS）

2015-02-10

A

1002-1280（2015）05-0032-05

S859.83

质检行业公益性科研专项（201010073-03）

李波平，硕士，工程师，从事进出口商品检测研究。E-mail：lbphappy＠163.com