黑木耳多糖对内毒素诱导急性肺损伤大鼠肺组织的保护作用*

高　阳，刘　斌，哈尼再尔·热合曼，李转运，孙　湛(新疆医科大学临床医学院，基础医学院，新疆乌鲁木齐830054)

黑木耳多糖对内毒素诱导急性肺损伤大鼠肺组织的保护作用*

高阳1，刘斌1，哈尼再尔·热合曼1，李转运1，孙湛2△
(新疆医科大学1临床医学院，2基础医学院，新疆乌鲁木齐830054)

［摘要］目的:探讨黑木耳多糖对LPS诱导急性肺损伤大鼠肺组织的保护作用及其机制。方法:将健康SD大鼠随机分为对照组、LPS组、地塞米松组以及黑木耳多糖低、中、高浓度组，根据分组，分别给予生理盐水或不同浓度黑木耳多糖预防性灌胃7 d，第8天腹腔注射生理盐水或LPS(8 mg/kg)，地塞米松组在给予LPS后腹腔注射地塞米松(3 mg/kg)。造模12 h后于腹主动脉取血，并制肺组织匀浆和肺泡灌洗液。检测支气管肺泡灌洗液中蛋白含量、肺湿/干重比、髓过氧化物酶(MPO)、总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、一氧化氮合酶(NOS)、丙二醛(MDA)等指标，做组织切片HE染色并进行肺损伤评分。结果:应用黑木耳多糖干预后，急性肺损伤大鼠支气管肺泡灌洗液中蛋白含量明显下降，肺湿/干重比值降低;大鼠肺组织中MPO、NOS活性及MDA含量较LPS组降低，T-AOC含量和T-SOD活性较之升高;肺组织病理改变减轻，肺损伤指数下降。结论:黑木耳多糖具有保护LPS损伤大鼠肺组织的作用，其机制可能与其抗氧化作用有关。

［关键词］黑木耳多糖;脂多糖;急性肺损伤;抗氧化作用

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是由各种肺内外致病因素导致的以顽固性低氧血症和呼吸窘迫为特征的全身炎症反应综合征，以大量中性粒细胞浸润，微血管和肺泡上皮广泛损伤，肺水肿及肺出血为病理特征，是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的早期阶段。ALI的治疗目前主要是保护性通气等支持性治疗［1］，尚未找到特效治疗措施，死亡率高达40%，寻找有效的方法降低ALI患者的死亡率是临床上迫切需要解决的问题。内毒素即脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的成分，是引起脓毒症肺损伤的主要致病因子。采用内毒素注射复制急性内毒素性ALI动物模型是科研工作中的常用手段之一。在急性内毒素性ALI发展过程中，氧自由基释放可产生脂质过氧化损伤，破坏细胞膜性结构，增加肺泡上皮细胞及肺泡毛细血管内皮细胞的通透性，促进ALI的发展。现有研究发现，黑木耳多糖(Auricularia auricular-judae polysaccharide，AAP)有抗炎［2］、提高免疫力［3］等功能。在我们先前的研究中发现，其对脓毒血症大鼠肝功能有保护作用［4］，在急性肾衰竭发病过程中也有一定保护作用［5］。另外，在细胞实验中发现，黑木耳多糖能减轻大鼠心肌细胞过氧化损伤［6］。本研究旨在探讨黑木耳多糖对LPS诱导急性肺损伤时对肺脏的保护作用，并探讨其可能机制。

材料和方法

1实验动物和主要试剂

健康雄性SD大鼠72只，雌雄不限，体质量200～220 g，购于新疆医科大学实验动物中心。

LPS(E.coli O55∶B5)购自Sigma;髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)试剂盒、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)试剂盒、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)试剂盒、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)试剂盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;地塞米松磷酸钠注射液购自湖北潜江制药股份有限公司;东北黑木耳购自厦门嘉祺生物食品有限公司，生产许可证号QS350216010315。

2方法

2.1黑木耳多糖的提取与纯化采用热水浸提法抽提黑木耳中的水溶性多糖: 300 g黑木耳，40倍蒸馏水浸泡30 min，90℃热水浸提3.5 h，重复抽提3次，蒸发浓缩至300 mL，即黑木耳多糖浓度为1%。2.2动物分组及ALI模型建立将雄性SD大鼠随机分为对照组、LPS组、地塞米松组及黑木耳多糖低、中、高组，每组12只。对照组、LPS组和地塞米松组使用生理盐水灌胃，黑木耳多糖低、中、高组分别使用50 mg/kg、75 mg/kg和100 mg/kg纯化黑木耳多糖灌胃，每天2次，连续7 d，剂量为10 mL/kg。第8天，经腹腔注射生理盐水或LPS(8 mg/kg)，地塞米松组注射LPS 3 h后，经腹腔给予地塞米松(3 mg/kg)。

2.3肺湿/干重比值(W/D)测定各组小鼠腹腔注射生理盐水或LPS后12 h，留取右肺上叶，用滤纸吸净表面血液，称肺湿重(wet，W)后将肺组织置于80℃烤箱内烘烤72 h至组织完全脱水，称肺干重(dry，D)，计算肺W/D值，以评价肺组织的水肿程度。

2.4支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的蛋白测定打开胸腔，用止血钳夹闭右侧主支气管，在气管上段部分剪断，插入16号针头，用4℃的PBS进行左肺灌洗，每次1 mL，反复灌洗2次后抽出，共3次。灌洗液经3 000 r/min离心10 min，留取上清液检测蛋白含量。

2.5肺组织中MDA含量、T-AOC及MPO、NOS、TSOD活性的测定SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法) ; T-AOC及MPO、NOS活性测定采用化学比色法; MDA含量测定采用TBA比色法。腹腔注射NS或LPS后12 h，立即处死大鼠取右肺中叶匀浆，测定肺组织中MDA含量、T-AOC及MPO、NOS、T-SOD活性，具体操作按南京建成生物工程研究所试剂盒操作说明进行。

2.6肺组织病理学检查取右肺下叶做病理切片，分别置于10%甲醛液中固定、石蜡包埋，制作HE染色切片。光镜下观察其病理改变，按Mikawa等［7］方法进行肺损伤评分。评分标准如下:对肺泡充血，出血，肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润或聚集、肺泡壁增厚和(或)透明膜形成4项指标，分别依照病变轻重评0～4分(0:无病变或非常轻微; 1:轻度病变; 2:中度病变; 3:重度病变; 4:极重度病变)。各项评定分数相加为肺损伤总评分。

3统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件包对数据进行处理，数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，不同处理组间的两两比较行SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1各组大鼠肺组织BALF蛋白含量和肺湿/干重比值

LPS组、黑木耳多糖低、中、高剂量组及地塞米松组的BALF蛋白水平和肺湿/干重比值均高于对照组(P＜0.05) ;黑木耳多糖低、中、高剂量组及地塞米松组的BALF蛋白水平较LPS组降低，但差异没有统计学意义;黑木耳多糖中剂量组、高剂量组及地塞米松组的肺湿/干重比值明显低于LPS组(P＜0.05)，见图1。

Figure 1.The protein concentration in BALF and lung W/D ratio of the rats with different treatments.Mean±SD.n=12.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.图1不同处理对大鼠肺组织BALF蛋白含量和肺湿/干重比值的影响

2肺组织损伤评分

光镜下观察可见对照组肺组织结构完整，无出血、水肿; LPS组可见大量炎性细胞浸润，肺泡壁结构破坏、肺间质水肿、肺泡腔和间质可见大量红细胞，肉眼见片状出血灶;与LPS组相比，黑木耳多糖各浓度组肺泡结构损伤轻微，间质水肿、炎性细胞浸润和出血等情况均显著减轻。LPS组肺组织损伤评分较正常组明显增加，而黑木耳多糖预处理各浓度组的肺损伤程度明显减轻，损伤评分下降，与LPS组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.HE staining of the rat lung tissue and the lung injury scores in different groups (×400).Mean±SD.n=12.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.图2各组大鼠肺组织HE染色及肺组织的损伤评分

3黑木耳多糖对大鼠肺组织T-SOD活性、T-AOC 和MDA含量的影响

LPS组、黑木耳多糖低、中、高剂量组大鼠肺组织中的T-SOD活性较对照组降低，黑木耳多糖高剂量组、地塞米松组大鼠肺组织中T-SOD活性较LPS组明显升高(P＜0.05)。LPS组、黑木耳多糖低、中、高剂量组及地塞米松组大鼠肺组织中的T-AOC均低于对照组，黑木耳多糖高剂量组及地塞米松组大鼠肺组织中的T-AOC低于LPS组(P＜0.05)。LPS组、黑木耳多糖低、中剂量组大鼠肺组织中的MDA含量较对照组升高，黑木耳多糖中剂量组、高剂量组及地塞米松组大鼠肺组织中的MDA含量较LPS组降低(P＜0.05)，见图3。

Figure 3.The level of the T-SOD activity，T-AOC and MDA content of the rats with different treatments.Mean±SD.n=12.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.图3不同处理对大鼠肺组织T-SOD活性、T-AOC及MDA含量的影响

4黑木耳多糖对大鼠肺组织MPO和NOS活性的影响

LPS组、黑木耳多糖低剂量组大鼠肺组织中的MPO活性较对照组升高，黑木耳多糖低剂量组、中剂量组、高剂量组及地塞米松组大鼠肺组织中的MPO活性较LPS组降低(P＜0.05) ; LPS组、黑木耳多糖低、中、高剂量组及地塞米松组大鼠肺组织中的NOS活性均高于对照组，黑木耳多糖低、中、高剂量组及地塞米松组的NOS活性较LPS组明显降低(P＜0.05)，见图4。

讨论

肺是内毒素血症的易损器官之一，内毒素入血及继发产生的大量炎症细胞因子，可很快引起肺内中性粒细胞的聚集和激活，造成肺的损伤。肺受损伤之后大量释放炎症细胞因子，除加重肺自身损伤外，也加重全身炎症反应，导致全身脏器的损伤［8］。内毒素性肺损伤时，机体炎症介质失衡，同时产生大量的氧自由基，引起脂质过氧化，直接导致组织损伤。本研究中，LPS组大鼠肺组织中可见大量炎性细胞浸润，肺泡壁结构破坏、肺间质水肿、肺泡腔和间质可见大量红细胞，肉眼见片状出血灶;而黑木耳多糖能减轻上述病理损害。LPS可引起BALF中的蛋白含量和肺组织湿/干重比值增加，而黑木耳多糖干预组后各组大鼠BALF中的蛋白含量和肺组织W/D明显低于LPS组，提示黑木耳多糖可以减轻由LPS引起的急性肺损伤。

Figure 4.The levels of the MPO and NOS activity of the rats with different treatments.Mean±SD.n=12.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.图4不同处理对大鼠肺组织MPO和NOS活性的影响

组织的MDA水平反映组织脂质过氧化程度，抑制脂质过氧化可显著减轻内毒素诱导的肺损伤［9-10］。SOD是机体中主要的抗氧化酶，其通过清除机体细胞内自由基来保护细胞免受氧化应激损伤［11］，所以SOD活性是衡量机体抗氧化能力的重要指标。TAOC氧化防御体系由酶促和非酶促组成，T-AOC测定能客观反映机体内抗氧化酶类的浓度，代表了生物体总抗氧化能力。本研究发现LPS组大鼠肺组织中的MDA含量明显增加，而SOD活性和T-AOC明显降低，给予黑木耳多糖的各组大鼠肺组织中MDA含量较LPS组明显下降，SOD活性和T-AOC较LPS组大鼠明显升高，提示黑木耳多糖能减轻由LPS引起的肺脏氧化损伤，且随着黑木耳多糖浓度增加，这种抗氧化损伤的作用也逐渐增强。

MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒产生的一种重要的过氧化物酶，既可以定量测定中性粒细胞的数目以反映中性粒细胞的浸润情况，又可定量反映炎症损伤的程度。研究中发现LPS能显著增加肺组织中的MPO活性，而黑木耳多糖能有效降低肺组织中的MPO浓度，且随着黑木耳多糖浓度增加，该作用逐渐增强。体内炎症因子激活诱导型一氧化氮合酶，产生大量的NO。NO为一种自由基气体，是一种生理和病理介质。正常情况下，NO起着宿主防疫作用，但过量的NO可导致各种慢性炎症。黑木耳多糖干预组NOS活性显著低于LPS组，提示黑木耳多糖能减轻机体的炎症反应。

综上所述，黑木耳多糖能减轻LPS引起的急性肺损伤，其作用可能与清除氧自由基及炎症因子，减轻氧化应激反应有关。

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(责任编辑:卢萍，罗森)

Protective effect of Auricularia auricular-judae polysaccharide on pulmonary tissues of rats with LPS-induced acute lung injury

GAO Yang1，LIU Bin1，Hanizaier REHEMAN1，LI Zhuan-yun1，SUN Zhan2
(1Clinical College，2Preclinical Medical College，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China.E-mail: sunzhan724@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effects of Auricularia auricular-judae polysaccharide (AAP) on pulmonary tissues of rats with LPS-induced acute lung injury (ALI) and its mechanisms.METHODS: Adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group，LPS group，low-dose AAP group，middle-dose AAP group，high-dose APP group，and dexamethasone group.The rats were injected with LPS (8 mg/kg，ip) to induce ALI.The rats in the AAP groups were treated with AAP for 7 d before the induction of ALI.The protein concentration in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was measured.The lung edema degree was measured by detecting the wet/dry weight ratio.The myeloperoxidase (MPO)，total antioxidant capacity (T-AOC)，total superoxide dismutase (T-SOD)，nitric oxide synthase (NOS) and malondialdehyde (MDA) levels were determined.The pathological changes of the lung tissues were evaluated by HE staining.RESULTS: Treatment with AAP significantly improved LPS-induced lung pathological changes，attenuated the protein concentration in the BALF and wet/dry weight ratio，inhibited the activities of MPO and NOS，reduced MDA level and increased the activities of T-AOC and T-SOD.CONCLUSION: AAP protects against LPS-induced acute lung injury in rats.

［KEY WORDS］Auricularia auricular-judae polysaccharides; Lipopolysaccharides; Acute lung injury; Antioxidation

通讯作者△Tel: 0991-4360915; E-mail: sunzhan724@126.com

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目(No.81260454) ;新疆维吾尔自治区大学生创新实验项目(No.CX2014021)

［收稿日期］2015-04-29［修回日期］2015-07-20

［文章编号］1000-4718(2015)09-1704-06

［中图分类号］R363.1

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.031