通过激活TRPV1达到快速有效治疗性浅低温方法的探讨*

岳　静，　陈　雯，　向桂芳，　李新华，　周碧云，　艾　玲，　陈明兵△(华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心，麻醉学教研室，湖北武汉430030)

通过激活TRPV1达到快速有效治疗性浅低温方法的探讨*

岳静1，陈雯1，向桂芳1，李新华2，周碧云2，艾玲2，陈明兵2△
(华中科技大学同济医学院附属同济医院1生殖医学中心，2麻醉学教研室，湖北武汉430030)

［摘要］目的:通过二氢辣椒碱(DHC)调控瞬时受体电位阳离子通道香草酸亚型1(TRPV1)，探讨达到治疗性浅低温的方法。方法: (1)观察不同剂量DHC(2、3和4 mg/kg)皮下注射对小鼠体温的影响，以20% DMSO溶于生理盐水为对照组，寻求达到目标温度(32～34℃)所需的最佳剂量; (2)清醒CD-1小鼠单次皮下注射最佳剂量DHC后，按1 mg· kg(－1)·h(-1)的速度持续输注DHC，观察是否有快速降温及维持治疗性浅低温的最长时间; (3)相同剂量DHC皮下注射于成年(9～10周)和老年(24～27月)小鼠，观察小鼠体温变化。结果: (1)单次注射2 mg/kg DHC可在15 min内达到治疗性浅低温; (2)单次注射2 mg/kg DHC后，按1 mg·kg(－1)·h(－1)的速度持续输注DHC可快速降温，还可维持治疗性浅低温6 h; (3) DHC介导的低体温在不同年龄模型中均适用。结论: DHC通过激活TRPV1通路可产生治疗性低体温，该方法可达到更强和更久的中心体温降低，在不同年龄模型中均适用。

［关键词］瞬时受体电位阳离子通道;治疗性浅低温;体温调节

［修回日期］2015-05-07

在中国，中风是导致死亡和长期残疾主要原因之一。鉴于80%以上缺血性中风是非致死性的，脑卒中发生后病人的治疗及康复应当得以重视。现已证明，浅低温(32～34℃)在心脏骤停及脑缺血等导致的脑损伤中可起到保护作用［1-3］。动物实验也证实低体温可产生中风后神经保护作用［4-5］。

传统治疗性低温(therapeutic hypothermia，TH)是通过冷毛毯、酒精浴和体外降温等方式缓慢降低中枢体温。因耗时长，并发症多，操作复杂，大大降低了其可行性和有效性［6-8］。

瞬时受体电位阳离子通道香草酸亚型1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1，TRPV1)是表达于热敏神经纤维的热敏受体，2005～2007年，有学者发现其参与了体温调节［9-10］。二氢辣椒碱(dihydrocapsaicin，DHC)是TRPV1激动剂。已有研究发现，通过DHC药理性激活TRPV1，中枢体温过高的“假的”信息被传递到下丘脑，启动机体的降温机制，可以达到治疗性浅体温，发挥神经保护的作用［11-12］。

但如何将中枢体温快速降低到治疗范围(32～34℃)且能够长时间维持在有效的治疗窗内，具体的诱导方法尚需研究;而且，年龄可能会影响TRPV1的作用［13］，这种诱导治疗性低温的方法是否适用于不同年龄组个体，尚缺乏实验资料。因此，本研究旨在利用DHC激活TRPV1，探讨达到治疗性浅低温的具体方法。与传统降温方式相比，寻求更加简单易行且降温迅速持久的降温方法。

材料和方法

1材料

1.1动物CD-1小鼠，雌雄不限，9～10周龄(成年，26～30 g)或24～27月龄(老年，35～42 g)，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，许可证编号为SCXK2004-007。

1.2实验器材带数据记忆功能的电子温度计(HH806W，Omega Engineering Inc.) ;热电偶(40 G wire，Omega Engineering Inc.) ; PE-10导管(Instech Solomon Inc.) ;微量注射泵(Omega Engineering Inc.)。

1.3药品DHC(Cayman)，以1 g/L的浓度溶于DMSO，注射前用生理盐水稀释5倍。

2实验方法

所有手术过程中的小鼠通过异氟醚(5%诱导，2%维持)麻醉。术中，小鼠中枢体温通过连接在身下的加温垫维持在37℃左右。当小鼠不需要温度支持，且中枢体温保持在36℃以上时，转移到温暖的鼠笼中。注药装备及热电偶的放置(图1) :在小鼠后颈根部造一个小口，放入一根或两根PE-10导管。导管埋置在皮下近尾部，终止于腹部以上区域。一根热电偶以相同的方式置入并到达腹部侧面区域。腹壁用20 G针穿孔，放入热电偶以测量腹腔温度(近似中枢体温)。用缝线固定导管和电偶以防滑脱。热电偶从颈部传出的导管中穿过并固定于鼠笼上。PE-10导管连接于独立的微量注射泵用于注射药物。植入热电偶和测量环境温度的自由热电偶连接于一个带数据记忆功能的电子温度计上，测量并记录腹腔体温。

Figure 1.The drug injection equipment and thermocouple.图1注药装备及热电偶的放置

给予清醒CD-1小鼠皮下单次注入不同剂量DHC (2、3和4 mg/kg)，对照组给与20% DMSO溶于生理盐水，观察其对体温的影响;然后使用一个持续输注装置来找到一个可以维持在治疗范围的稳定中枢体温DHC浓度。整个实验过程中的环境温度保持在24℃。

3统计学处理

数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间单独比较使用t检验。组间重复测量资料使用重复测量ANOVA，多重比较使用Holm-Sidak检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1皮下给予不同剂量DHC对中枢体温的影响

DC-1小鼠皮下注射DHC 2 mg/kg，中枢体温可达到目标治疗范围;当剂量达3 mg/kg或4 mg/kg，中枢体温低于目标体温;且2 mg/kg的注射剂量可使中枢体温维持在目标治疗范围达70 min，见图2。

2单次注射2 mg/kg DHC后给予清醒小鼠1 mg ·kg－1·h－1的持续剂量对中枢体温的影响

给予清醒DC-1小鼠单次注射DHC 2 mg/kg，然后按1 mg·kg－1·h－1的速度持续输注，能够快速达到目标温度，持续注入DHC还可产生一个更稳定的枢体温降低，6 h持续灌注后体温迅速降低到34℃并维持在32～34℃。一旦输注停止，中枢体温则缓慢的上升到初始基础值。从34℃上升到36℃所需时间为(45±2) min，上升速度为(0.045±0.002) ℃/min，显著低于初始体温降低速度，见图3。

Figure 2.DHC decreased the core temperature of awaken mouse in a dose-dependent manner.Grey area means 32～34℃.n=4.图2不同浓度DHC使清醒小鼠体温呈浓度依赖性下降

Figure 3.After a bolus dose (2 mg/kg) of DHC was delivered at 0 min followed by continuous infusion (1 mg· kg－1· h－1) beginning at 30 min，the core temperature of the mice rapidly dropped to 34℃and then maintained the temperature within 32～34℃range (grey area) for the duration of 6 h (n=4).

图3单次注射2 mg/kg DHC，然后持续给予1 mg·kg－1·h－1DHC，清醒小鼠能够维持目标温度6 h

3 DHC介导的低体温在不同年龄模型中均适用

由于中风主要发病于老年群体，任何疗法都应对老龄模型有效。给成年(9～10周)和老年(24～27月)小鼠均注射等剂量DHC (1.25 mg/kg)，发现老年组体温的最大下降值比成年组大，低温持续时间比成年组长，见图4。

Figure 4.The effect of DHC on the mice at various ages.Mean ±SD.n=5.*P＜0.05 vs adult.图4 DHC对不同年龄小鼠低温持续时间的影响

讨论

在中国，急性脑出血是导致死亡和长期残疾主要原因之一。大量动物实验和临床研究证明，治疗性浅体温(32～34℃)在心脏骤停及脑出血等导致的脑损伤中起到保护作用，且越早使用治疗性浅低温对脑出血病人预后越好［1-3］。

治疗性低温是通过物理和药物的降温方式使人体中心体温下降达到治疗的目的，其中治疗性浅体温对治疗脑损伤的效果最好。目前临床上常用的是物理性降温的方法，包括各种冰帽、冷毛毯、酒精浴等体外冷却方法，一般需要2～3 h才能达到目标温度。但当体温达到目标温度时，病人往往出现寒战等副反应。为有效控制寒战，必须通过联合使用肌松药或镇静麻醉剂来治疗寒战及长期寒战引起的并发症。但是肌松药或镇静麻醉剂的使用却会导致呼吸抑制，因此需要持续的机械通气，这使得传统的治疗性浅体温操作复杂，大大降低了它的实用性和有效性［6］。

在本研究中发现，皮下注射DHC在小剂量低温诱导小鼠中耐受良好，主要表现为小鼠活动量减少。一项单独的研究指出，相近剂量(0.75 mg ·kg－1· h－1)的皮下注射DHC在大鼠表现出同样良好的耐受性。但有些作者发现1 mg·kg－1·h－1的注射量会产生轻微的心律加快，血压升高，呼吸速率降低等副反应。这些副反应的发生率通常≤10%，且与任何外部压力或不适迹象无关。需要注意的是，1 mg ·kg－1·h－1的用量略大于在此模型中产生浅低温所需的剂量。若提高DHC用量(2.2～3 mg·kg－1·h－1)，会引起短暂的低血压(＜2 min)、心动过缓和心电图改变。引起心血管变化所需剂量比引起浅低温所需的剂量至少要高3倍。很多研究显示，尽早降温可最大限度保护神经。然而，也有研究报道虽然降温不及时，但延长降温时间仍然可以保护神经。尽管较长时间的低温期也有不良后果，但它可能与感染、心律失常和电解质紊乱等并发症有关。我们认为相比之下患者神经脑保护更为重要。当然我们要尽量缩短从受伤到达到治疗的目标温度之间的时间，这对于这类患者尤为重要。

一些研究显示，通过多次注射TRPV1激动剂能产生可持续性低温。我们试图调整此降温的方法，使其更好地应用于临床。第一步，本研究证明了达到治疗温度的时间可缩减3倍多至29 min。另外，浅低温范围可通过持续泵注稳定维持长达6 h。由此，这些方法都证明快速诱导和长时间维持治疗性低温的临床可能性。此外，原则上，通过就地(患者家里、车祸现场或战场上)开始这些降温方法，达到治疗目标温度的时间还可能进一步缩短。而且复温速度明显低于降温速度，也降低了快速复温的一些并发症，从而为大幅度提高这类患者生存率提供可能。

中风和心脏骤停患者病理上与高龄有明显联系，适合老龄人口的治疗性低体温疗法显得格外重要。主要现存的产生治疗性低体温的方法包括激活TRPV1通路。研究发现，TRPV1通道在高龄小鼠的背根神经节和外周神经表达减少。换言之，高龄小鼠相比成年鼠除了有更大量的隔热脂肪以外还有更强的非寒战产热能力。让人意外的是，当我们评估不同年龄小鼠DHC介导的低体温时，发现老年组对DHC有更强的反应——低体温时效明显延长。对于此发现一种可能的解释是，相比于成年小鼠，寒战产热能力的降低和新陈代谢的降低导致高龄鼠冷防御产热缺陷，或年龄差异引起不同的药物代谢率和清除率。此外，以上发现表明DHC介导的低体温可以重复使用而不失效，并且在成年和老年模型中都有明显作用［6-8］。

综上所述，本研究发现通过激活TRPV1通路产生治疗性低体温的方法，并更进一步论证该方法可达到更强和更久的中心体温降低。该方法无需联合使用强镇静药物和肌松药以阻止冷防御反应，因此适合清醒有自主呼吸的不同年龄层患者。

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(责任编辑:林白霜，罗森)

Synergistic effect of TRPV1 activation on promoting mild therapeutic hypothermia

YUE Jing1，CHEN Wen1，XIANG Gui-fang1，LI Xin-hua2，ZHOU Bi-yun2，AI Ling2，CHEN Ming-bing2
(1Department of Reproductive Medical Center，2Department of Anesthesiology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science＆Technology，Wuhan 430030，China.E-mail: chenmingbing808@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To look for a way of produ cing mild therapeutic hypothermia through regulating transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) pathway by dihydrocapsaicin (DHC).METHODS: Mice were subcutaneously injected with DHC at different doses (2 mg/kg，3 mg/kg and 4 mg/kg) in order to find the best dose for reaching the target temperature (32～34℃).20% DMSO dissolved in normal saline was used as control group.After a single subcutaneous injection of DHC at an optimal dose was given，awaken CD1 mice were continuously infused with DHC at dose of 1 mg· kg(－1)·h(－1)for providing a more rapid and stable temperature drop and duration of therapeutic mild hypothermia.The adult mice (9～10 weeks) and aged mice (24～27 months) were subcutaneously injected with DHC at the same dose，and the changes of the body temperature were monitored.RESULTS: DHC at 2 mg/kg resulted in a decrease in the core temperature within the target therapeutic range (32～34°C).After a bolus dose (2 mg/kg) was delivered at 0 min followed by continuous infusion (1 mg·kg(－1)·h(－1)) beginning at 30 min，a rapid drop of body temperature to 34℃was achieved and the body temperature was maintained within the ranges of 32 to 34℃for the duration of the 6 h continuous infusion.DHC-mediated hypothermia did not lose its effectiveness in the adult and aged models.CONCLUSION: DHC-induced activation of TRPV1 pathway produces mild therapeutic hypothermia.Besides，this method achieves stronger and longer center hypothermia and is suitable for the animals at different ages.

［KEY WORDS］Transient receptor potential cation channels; Mild therapeutic hypothermia; Thermoregulation

通讯作者△Tel: 027-83663423; E-mail: chenmingbing808@163.com

*［基金项目］湖北省自然科学基金资助项目(No.2013CFB130; No.2013CFB119; No.2013CFB140)

［收稿日期］2015-04-07

［文章编号］1000-4718(2015)09-1633-04

［中图分类号］R363; R459.4

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.018