抑制自噬促进MK-2206诱导SGC-7901胃癌细胞发生DNA损伤*

张　翠，姜文艳，吴玉梅，庄梦玮，王西双，焦　鹏(泰山医学院生命科学学院，山东泰安706;胜利油田机关医院药剂科，山东东营57000;泰山医学院生命科学研究中心，山东泰安706)

抑制自噬促进MK-2206诱导SGC-7901胃癌细胞发生DNA损伤*

张翠1，姜文艳1，吴玉梅2，庄梦玮1，王西双1，焦鹏3△
(1泰山医学院生命科学学院，山东泰安271016;2胜利油田机关医院药剂科，山东东营257000;3泰山医学院生命科学研究中心，山东泰安271016)

［摘要］目的:探讨蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)抑制剂MK-2206对胃癌细胞SGC-7901DNA损伤的影响。方法:不同浓度的MK-2206作用于SGC-7901细胞后，免疫荧光检测细胞内DNA损伤标记分子磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)焦点的生成，Western blot检测DNA损伤相关蛋白的表达水平，同时观察MK-2206对自噬标志蛋白LC3-II表达量的影响，用以确定MK-2206是否促进细胞发生自噬。结果: MK-2206能够诱导SGC-7901细胞发生DNA损伤，促进细胞内γ-H2AX焦点生成，并且激活DNA损伤相关蛋白的表达; MK-2206作用细胞后，LC3-II的生成增加;抑制细胞的自噬显著增强了MK-2206诱导的H2AX磷酸化水平。结论: Akt抑制剂MK-2206能够诱导细胞发生DNA损伤和自噬，抑制自噬促进了MK-2206诱导的DNA损伤。

［关键词］MK-2206; Akt抑制剂; DNA损伤;γ-H2AX;细胞自噬

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路参与细胞的增殖、存活和迁移等多种生命活动过程，与肿瘤的发生发展关系密切［1-2］。近年来，该通路多作为研究抗肿瘤治疗的靶点［3］。MK-2206是PI3K下游底物分子Akt的变构抑制剂，在多种肿瘤中显示出良好的抑癌活性，具有广阔的应用前景［4-6］。我们前期研究发现，MK-2206能够抑制肿瘤细胞的增殖并诱导细胞发生凋亡和自噬，协同促进肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的抗肿瘤活性［7］。本研究以SGC-7901胃癌细胞为研究对象，检测MK-2206对肿瘤细胞DNA损伤和自噬的作用，观察抑制自噬对MK-2206诱导DNA损伤的影响，为MK-2206的临床用药提供理论依据。

材料和方法

1材料

MK-2206购自Selleck Chemicals; RPMI-1640培养基和胎牛血清购自Gibco; DAPI、氯喹(chloroquine，CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、β-actin和LC3-II抗体购自Sigma; p-Akt抗体和细胞周期检测点激酶(checkpoint kinase，Chk) 1抗体购自Abcam;磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX，γ-H2AX)抗体、Akt抗体、p-Chk1抗体、Chk2抗体和p-Chk2抗体购自CST; HRP标记的Ⅱ抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司; FITC标记的羊抗兔Ⅱ抗购自Life Technologies。

2主要方法

2.1细胞培养胃癌细胞株SGC-7901由本室保存，常规传代培养。培养基采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。

2.2免疫荧光检测γ-H2AX焦点细胞接种于盖玻片上，继续培养24 h，然后用不同浓度的MK-2206 (10、20 μmol/L)作用18 h。PBS洗涤玻片2次，4%多聚甲醛固定20 min，Triton X-100打孔5 min，BSA室温封闭30 min，I抗室温孵育2 h，加入荧光II抗37℃孵育1 h，荧光显微镜下观察并采集图像。实验重复3次。

2.3Western blot法细胞用预冷的PBS洗2次后加入RIPA细胞裂解液，冰上放置20 min，4℃13 000×g离心20 min，收集上清，然后进行蛋白定量。取30 μg总蛋白进行SDS-PAGE，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜。加入相关I抗室温孵育3 h，II抗室温孵育1.5 h。最后ECL显色试剂盒于暗室曝光显影，实验重复3次。

2.4细胞内GFP-LC3融合蛋白的表达接种SGC-7901细胞于6孔板中，待细胞融合至80%左右使用Lipofectamine 2000转染GFP-LC3质粒。细胞转染24 h后，加入MK-2206继续处理24 h，倒置荧光显微镜下观察。GFP-LC3融合蛋白一般呈弥散状态分布于胞浆中;当细胞发生自噬时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成明亮的绿色斑点。

3统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件分析，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较应用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 MK-2206抑制SGC-7901细胞内Akt的磷酸化水平

Western blot结果显示，MK-2206显著抑制了胃癌SGC-7901细胞中Akt的磷酸化水平，见图1。

Figure 1.The effect of MK-2206 on the phosphorylation of Akt in the SGC-7901 cells treated with different concentrations of MK-2206 determined by Western blot.Mean ±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.图1 Western blot检测MK-2206对SGC-7901细胞内Akt磷酸化水平的影响

2 MK-2206增加细胞内γ-H2AX焦点的生成

接着，采用免疫荧光检测了MK-2206对细胞内γ-H2AX焦点数量的影响，从而来确定细胞内的DNA损伤的变化。从图中可以看出，SGC-7901细胞经MK-2206作用后，γ-H2AX的焦点数目明显增多，且随着MK-2206浓度的增加，细胞内γ-H2AX焦点数量呈递增趋势。以上结果表明，MK-2206可能诱导SGC-7901细胞发生DNA损伤，见图2。

Figure 2.The formation of γ-H2AX foci in the SGC-7901 cells treated with different concentrations of MK-2206.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.图2 MK-2206对SGC-7901细胞中γ-H2AX焦点生成的影响

3 MK-2206上调DNA损伤相关蛋白的表达

20 μmol/L的MK-2206上调了细胞内γ-H2AX的蛋白表达;与此同时，在MK-2206处理的细胞中，Chk2的磷酸化水平增加，而Chk1的磷酸化水平未见明显变化，见图3。

Figure 3.The effect of MK-2206 on the expression of DNA damage-related proteins detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.图3 Western blot检测MK-2206对DNA损伤相关蛋白表达水平的影响

4 MK-2206诱导胃癌细胞发生自噬

转染GFP-LC3质粒的胃癌细胞经MK-2206作用24 h后，荧光显微镜观察到细胞内LC3蛋白的绿色点状荧光，而对照组绿色荧光呈弥散分布，见图4。

同时，免疫印迹检测了细胞内LC3-II的表达。从图中可以看出，MK-2206处理SGC-7901细胞后，LC3-II的生成量明显增加;另外，自噬相关蛋白beclin-1的表达水平也上调，见图5。

Figure 4.The formation of LC3-positive vesicles in MK-2206-treated GFP-LC3 transfected cells.图4荧光显微镜观察MK-2206处理的SGC-7901细胞中GFP-LC3荧光的分布

5阻断自噬促进MK-2206诱导的DNA损伤

胃癌细胞经过自噬抑制剂CQ和3-MA预处理后，促进了MK-2206诱导的γ-H2AX表达，表明抑制自噬能够促进MK-2206诱导的SGC-7901细胞损伤，见图6。

Figure 5.MK-2206 increased the expression of beclin-1 and LC3-Ⅱ.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control (0 μmol/L) ;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LC3-I.图5 MK-2206促进胃癌细胞内beclin-1和LC3-Ⅱ的表达

Figure 6.Inhibition of autophagy enhanced MK-2206-mediated H2AX phosphorylation.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs MK-2206.图6抑制自噬促进MK-2206诱导的H2AX磷酸化

讨论

损伤DNA是临床治疗肿瘤常用的放、化疗治疗的手段，自噬与DNA损伤关系密切［8-9］。当细胞发生DNA损伤后，损伤识别因子便对损伤部位进行识别并修复，依据损伤的类型和程度不同，细胞会启动不同的信号转导通路。参与DNA损伤应答的关键因子有ATM、ATR和DNA-PK，其下游原件包括p53 和Akt等［10］。如果细胞有能力修复损伤的DNA，则出现细胞周期阻滞，进而促进DNA损伤修复;当DNA损伤严重或修复能力丧失，细胞启动线粒体凋亡通路诱导细胞发生凋亡［11-12］。因此，DNA修复能力异常激活和增强是导致肿瘤对DNA损伤剂耐药的重要分子基础，抑制DNA的修复则促进肿瘤对药物的敏感性。

H2AX是组蛋白的一个种类，普遍存在于整个基因组中。据报道，DNA双链断裂后可诱导位于丝氨酸-139位C-端保守区域内的组蛋白H2AX磷酸化形成γ-H2AX，在荧光显微镜下形成可见的γ-H2AX焦点。用特异性抗体的免疫荧光法检测γ-H2AX已成为衡量DNA双链断裂(double strand breaks，DSB)的标准［13］。当DNA损伤时，γ-H2AX招募修复蛋白并在DSB周围形成焦点。目前，γ-H2AX已经成为评价DSBs发生的标记分子，其形成与DNA双链损伤程度成正比。

调控细胞周期是抗肿瘤药物研究的重要方面。Chk1和Chk2在药物、电离辐射和紫外线等引起DNA损伤后被ATM和ATR磷酸化激活，在S期和G2期检测点调节中发挥重要作用，有可能成为肿瘤治疗放化疗增敏的新靶点［14］。

在本研究中，我们以胃癌SGC-7901细胞为研究对象，通过免疫荧光观察细胞内γ-H2AX焦点的生成来确认MK-2206对DNA损伤的诱导作用;通过免疫印迹检测细胞内DNA损伤应答相关因子表达水平的变化来探讨MK-2206诱导DNA损伤的可能作用机制。我们发现MK-2206处理SGC-7901细胞后，细胞内γ-H2AX的焦点增多，γ-H2AX的表达水平也增加，Chk2的磷酸化水平升高，表明MK-2206能够诱导SGC-7901细胞发生损伤，DNA损伤应答分子Chk2参与了该过程。

自噬是一种进化上高度保守的，由溶酶体介导的动态过程，是细胞在某些刺激因素(如DNA损伤、营养缺乏和缺氧等)作用下，细胞内膜性结构包围并降解损伤的细胞器或蛋白质的过程，参与了调节细胞物质的合成、降解和重新利用之间的代谢平衡［15-16］，以达到细胞更新作用。在本研究中，我们首先观察了MK-2206对SGC-7901细胞自噬的影响。与MK-2206作用于其它肿瘤细胞类似，MK-2206也能够诱导SGC-7901细胞发生自噬。细胞自噬与DNA损伤间有着密切的关系。一方面，DNA损伤能诱导细胞自噬的发生，这在多种DNA损伤诱导剂的细胞毒性模型中都得到了证实;另一方面，自噬同样参与调控受损DNA的修复，参与调节多种损伤修复关键酶的表达而加速受损DNA的修复进程。

为了探讨MK-2206诱导的胃癌细胞自噬与DNA损伤应答的相关性，我们应用自噬特异抑制剂氯喹和3-甲基腺嘌呤来观察自噬的发生对MK-2206诱导DNA损伤的影响。研究结果表明，与MK-2206单药作用细胞相比，自噬抑制剂氯喹和3-甲基腺嘌呤联合MK-2206处理SGC-7901细胞，对细胞内γ-H2AX的诱导作用明显增强。这说明MK-2206诱导的自噬可能是保护性自噬，它部分抑制了MK-2206诱导的胃癌细胞DNA损伤。MK-2206和自噬抑制剂的联合应用可能为胃癌的临床治疗提供新策略。

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(责任编辑:卢萍，余小慧)

Blocking autophagy magnifies MK-2206-induced DNA damage in SGC-7901 cells

ZHANG Cui1，JIANG Wen-yan1，WU Yu-mei2，ZHUANG Meng-wei1，WANG Xishuang1，JIAO Peng3
(1School of Life Sciences，Taishan Medical University，Tai’an 271016，China;2Department of Pharmacy，Office Hospital of Shengli Oil Field，Dongying 257000，China;3Life Sciences Research Centre，Taishan Medical University，Tai’an 271016，China.E-mail: jiaopeng196@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of MK-2206，an inhibitor of protein kinase B (Akt)，on the DNA damage of SGC-7901 cells.METHODS: SGC-7901 cells were treated with different concentrations of MK-2206，and phosphorylated histone H2AX (γ-H2AX) foci formation was detected by immunofluorescence staining.Western blot analysis was used to exam the levels of DNA damage-related protein.The expression of LC3-Ⅱwas determined to evaluate the change of autophagy.RESULTS: MK-2206 treatment increased the formation of γ-H2AX foci and histone H2AX phosphorylation in the SGC-7901 cells.The levels of DNA damage response protein were also increased.In addition，MK-2206-treated SGC-7901 cells increased the expression of LC3-II，a hallmark of autophagy.Inhibition of autophagy significantly enhanced MK-2206-mediated histone H2AX phosphorylation.CONCLUSION: MK-2206 induces DNA damage and autophagy in SGC-7901 cells.Blocking autophagy potentiates the response of MK-2206-induced DNA damage.

［KEY WORDS］MK-2206; Akt inhibitor; DNA damage;γ-H2AX; Cell autophagy

通讯作者:△ Tel: 0538-6225275; E-mail: jiaopeng196@163.com

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目(No.81272683) ;山东省自然科学基金资助项目(No.ZR2014HL107) ;泰安市科技发展计划项目(No.201440774-14)

［收稿日期］2015-03-31［修回日期］2015-06-16

［文章编号］1000-4718(2015)09-1545-05

［中图分类号］R730.23; R735.2

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.002