表没食子儿茶素没食子酸酯通过调控P53/miR-34a抑制鼻咽癌细胞的增殖*

李彬彬，万　郑，孔　霞，廖　丹，王籽又，黄国良△(广东医学院病理生理学教研室，广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞53808)

表没食子儿茶素没食子酸酯通过调控P53/miR-34a抑制鼻咽癌细胞的增殖*

李彬彬1，2，万郑2，孔霞1，廖丹1，王籽又1，黄国良2△
(广东医学院1病理生理学教研室，2广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞523808)

［摘要］目的:观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对鼻咽癌细胞增殖的影响，并以微小RNA-34a (miR-34a)为靶点探讨其作用机制。方法:不同浓度的EGCG处理CNE-2Z细胞，CCK-8法、EdU染色法和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力的改变;流式细胞术检测细胞周期分布的改变; Western blot检测P53和Notch1蛋白水平的变化; real-time PCR检测miR-34a和Notch1 mRNA的表达。结果: EGCG处理后，CNE-2Z细胞的增殖受到明显抑制，克隆形成能力降低，细胞周期阻滞于G0/G1期，呈剂量依赖关系;随着EGCG浓度增高，P53和miR-34a的表达水平明显上调，而其下游Notch1 mRNA和蛋白的表达水平则明显下降。结论: EGCG可能通过调控P53/miR-34a/Notch1通路诱导细胞周期阻滞，抑制鼻咽癌细胞增殖。

［关键词］表没食子儿茶素没食子酸酯;鼻咽癌; P53;微小RNA-34a; Notch1

［修回日期］2015-05-21

△通迅作者Tel: 0769-22896402; E-mail: 44775879@qq.com

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是高发于我国南方地区和东南亚国家的恶性肿瘤之一。该肿瘤原发部位隐蔽，不易早期发现，恶性程度较高，易呈浸润性生长及早期转移。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段，但单一放疗手段治疗中晚期鼻咽癌病例，5～10年生存率仅有40%左右。因此，寻找有效低毒的天然药物或综合治疗方案，并探讨其作用机制，对于提高鼻咽癌的临床疗效及预后，改善患者生活质量有着重要意义。

表没食子儿茶素没食子酸酯［(－) -epigallocatechin-3-gallate，EGCG］是绿茶中含量最高和最具有药用功效的活性成分。近年来，EGCG在肿瘤预防及抗肿瘤活性上展现了很好的前景。体内动物实验和体外细胞实验等均发现EGCG对肺癌、宫颈癌、胃癌、结肠癌、肝癌和鼻咽癌等多种肿瘤的发生、发展有抑制作用。Ruan等［1］对我国广东省两千多名个体进行病例对照研究，发现喝茶与较低的鼻咽癌发病风险相关。近年来研究显示，多种微小RNA(microRNA，miRNA)发挥肿瘤抑制因子或致癌因子的作用，参与调控肿瘤细胞增殖、凋亡、黏附和血管生成等多个生物学过程，有望成为肿瘤治疗的新靶点［2］。本研究旨在观察EGCG对鼻咽癌细胞株CNE-2Z增殖和细胞周期的影响，并以miRNA-34a为靶点，探讨其作用机制。

材料和方法

1主要试剂

EGCG购自Sigma，由PBS配成1 g/L，－20℃避光保存; CCK-8试剂盒购自Dojindo; EdU试剂盒购自广州锐博生物科技公司; TRIzol试剂购自Invitrogen; real-time PCR相关试剂购自Promega; FS Universal SYBR Green Master购自Roche;兔抗人P53多抗购自Cell Signaling;兔抗人Notch1多抗和鼠抗人β-actin单抗购自Santa Cruz;红外标记羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗购自Rockland。

2方法

2.1细胞培养人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2Z为本实验室保存，采用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清，1×105U/L青霉素，100 mg/L链霉素)在37℃、5% CO2培养箱中培养。

2.2CCK-8法检测细胞活性取对数生长期CNE-2Z细胞，以3 000 cells/well接种到96孔板，培养24 h后换含不同浓度(10和20 μmol/L) EGCG的RPMI-1640培养基(含2%胎牛血清)处理，每组设5个平行孔;分别于24 h、48 h和72 h在每孔加入CCK-8工作液100 μL(含10 μL CCK-8溶液)，继续培养2 h，在多功能酶标仪上测定450 nm波长各孔光吸收值(A值)，计算细胞抑制率。细胞抑制率(%)=(对照组A值－实验组A值)/对照组A值×100%。

2.3EdU掺入法检测细胞增殖取对数生长期CNE-2Z细胞，以3 000 cells/well接种到96孔板，培养24 h后换含不同浓度(10和20 μmol/L) EGCG的RPMI-1640培养基(含2%胎牛血清)继续培养24 h，每组设3个平行孔;加入终质量浓度为50 μmol/L的EdU，继续培养2 h;加入4%多聚甲醛固定30 min，0.5% Triton X-100室温孵育20 min;加入1×Apollo反应液100 μL避光孵育30 min，再加入5 mg/L Hoechst 33342避光孵育30 min; PBS清洗后，荧光显微镜下采集图像。蓝色为细胞核，红色为EdU标记处于增殖期的细胞，细胞增殖率=增殖细胞数/总细胞数×100%。

2.4平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力取对数生长期CNE-2Z细胞，以400 cells/well接种到6孔板，培养24 h后给予不同浓度(5和10 μmol/L) EGCG处理，每组设3个平行孔，连续培养约2周;用PBS清洗细胞2次，甲醇固定15 min后，0.4%结晶紫染色15 min，流水冲洗;将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，直接计数克隆数。

2.5流式细胞仪检测细胞周期分布取对数生长期CNE-2Z细胞接种于6孔板，待细胞长至60%～70%满度后换无血清培养基培养24 h，使细胞周期同步化;再给予不同浓度(10和20 μmol/L) EGCG处理24 h，每组设3个平行孔;收集细胞，加入预冷的70%乙醇固定，4℃过夜;离心后加入终浓度为100 mg/L RNase和100 mg/L PI染色液400 μL，混匀，室温避光染色30 min;采用BD FACSCantoⅡ流式细胞仪进行检测分析。

2.6Western blot检测P53和Notch1的蛋白表达不同浓度的EGCG(10和20 μmol/L)处理CNE-2Z细胞24 h后，加入细胞裂解液提取总蛋白;采用BCA法测定蛋白浓度后加入等量蛋白样品进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶中的蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h;加入I抗［P53抗体和Notch1抗体(1∶500)］，4℃孵育过夜;加入红外标记的II抗(1∶10 000)，室温孵育2 h; Odyssey近红外双色激光成像系统扫描成像，Quantity One软件进行条带灰度分析。以β-actin作为内参照。

2.7Real-time PCR检测miR-34a和Notch1 mRNA表达不同浓度的EGCG(10和20 μmol/L)处理CNE-2Z细胞24 h后，TRIzol提取总RNA。采用带茎环结构的miR-34a特异性逆转录引物进行逆转录反应合成cDNA;以cDNA为模板，采用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法在ABI 7500实时定量PCR仪进行PCR反应，以U6 RNA作为内参照;引物购自广州锐博生物科技有限公司。采用Oligo(dT)引物进行逆转录反应合成cDNA;以cDNA为模板，real-time PCR反应检测Notch1 mRNA表达的上游引物为5’-GTCAACGCCGTAGATGACCT-3’，下游引物为5’-TCTCCTCCCTGTTGTTCTGC-3’，以GAPDH作为内参照;引物由上海生工生物工程有限公司合成。所有标本均重复3次，计算出Ct值，采用2－ΔΔCt法进行计算分析。

3统计学处理

应用SPSS 17.0及GraphPad Prism统计学软件处理和分析实验数据。计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 CCK-8法检测EGCG对CNE-2Z细胞活性的影响

在预实验中，给予不同浓度的EGCG(5、10、20、40和80μmol/L)作用CNE-2Z细胞24 h，CCK-8结果显示，随着浓度的增加，EGCG对CNE-2Z细胞活性的抑制作用逐渐增强，其IC50为33.82 μmol/L。在此基础上，采用10 μmol/L和20 μmol/L EGCG作用CNE-2Z细胞不同时间(24 h、48 h和72 h)，结果如图1所示，随药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞活性的抑制率逐渐增加，具有明显的剂量和时间效应关系。

Figure 1.The effect of EGCG on the viability in CNE-2Z cells detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n=3.图1 EGCG对CNE-2Z细胞活性的影响

2 EdU掺入法检测EGCG对CNE-2Z细胞增殖的影响

与对照组相比，EGCG处理24 h组中EdU阳性的细胞明显减少，且呈剂量依赖关系，提示EGCG可以减少处于增殖期的细胞，具有抑制CNE-2Z细胞增殖的作用，见图2。

3 EGCG对CNE-2Z细胞克隆形成能力的影响

与对照组相比，5 μmol/L EGCG即可明显抑制CNE-2Z细胞的克隆形成能力，其克隆形成数目和克隆形成大小均减少(P＜0.05)。随着EGCG浓度的增加，其抑制作用更加明显，见图3。

4 EGCG对CNE-2Z细胞周期的影响

图4所示，与对照组相比，EGCG能诱导G0/G1期细胞的百分率增加，而S期细胞的百分率减少，呈剂量依赖性，提示EGCG能将CNE-2Z细胞周期阻滞于G0/G1期。

5 EGCG对CNE-2Z细胞P53表达的影响

Western blot实验结果显示，与对照组相比，随着浓度的增加，EGCG能明显提高P53蛋白的表达水平，呈剂量依赖关系，见图5。

6 EGCG对CNE-2Z细胞miR-34a表达的影响

Real-time PCR结果显示，EGCG能明显上调miR-34a的表达，并具有浓度依赖性，见图6。

7 EGCG对CNE-2Z细胞Notch1 mRNA和蛋白表达的影响

Real-time PCR和Western blot实验结果显示，与对照组相比，EGCG能明显抑制Notch1的mRNA和蛋白表达，呈剂量依赖性，见图7。

Figure 2.The results of EdU assay showed that EGCG inhibited the proliferation of CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.图2 EGCG对CNE-2Z细胞增殖的抑制作用

Figure 3.EGCG suppressed colony formation of CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.图3 EGCG抑制CNE-2Z细胞的克隆形成能力

讨论

绿茶为中华民族的传统保健饮料，几乎无毒副作用，其水溶性提取物含有多种多酚类化合物，其中EGCG的含量最高，也最具有药用功效。大量研究显示［3］，EGCG可通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、调节细胞代谢中关键酶活性、抑制肿瘤细胞的侵袭和转移以及调节肿瘤血管形成等多种机制发挥抗肿瘤作用。EGCG也发现能够提高机体免疫功能及增强肿瘤细胞对放疗的敏感性［4］。本研究应用不同浓度的EGCG处理鼻咽癌细胞CNE-2Z后，CCK-8法检测显示细胞生长受到明显抑制，呈现剂量和时间效应关系; EdU掺入法检测显示随着EGCG浓度的增加，EdU标记细胞的比例逐渐减少，表明EGCG具有抑制鼻咽癌细胞增殖的作用。此外，EGCG亦能明显地降低CNE-2Z细胞的克隆形成能力。流式细胞术检测发现，EGCG能将CNE-2Z细胞周期阻滞在G0/G1期，不能进入S期，这可能是EGCG抑制鼻咽癌细胞增殖的重要机制。

Figure 4.The effect of EGCG on the cell cycle distributions in CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.图4 EGCG对CNE-2Z细胞周期分布的影响

miRNA是真核生物体内一类具有调控功能的非编码RNA，长约19～25个核苷酸，在胞质中通过碱基互补配对结合到下游靶基因mRNA的3’UTR区域，抑制mRNA的翻译甚至促使其降解，进而调控靶基因的表达。近年来研究发现，miRNA表达或调控异常与人类多种肿瘤相关。miRNA参与调控重要肿瘤相关基因，发挥肿瘤抑制基因或者癌基因的功能，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。miR-34a是miR-34家族的成员之一，其基因位于人染色体的1p36.23，这一位点常伴随多个基因的缺失或突变，与肿瘤的发生密切相关。目前多数研究认为miR-34a在多种肿瘤中承担抑制因子的作用，外源性表达miR-34a可通过调控细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡和抑制细胞侵袭和转移等降低肿瘤细胞的恶性程度［5-6］。在神经母细胞瘤、前列腺癌、胃癌及非小细胞肺癌等中均发现有miR-34a的低表达或表达缺失，参与肿瘤的发生和进展过程［5，7］。p53作为最重要的抑癌基因，它的突变和缺失在多种肿瘤包括鼻咽癌中是一个最为常见的生物学事件。体内和体外的实验均表明，miR-34a是p53直接转录靶标，在肿瘤应激和DNA损伤的情况下，miR-34a通过p53依赖的方式诱导表达［8］。在多种肿瘤如慢性淋巴细胞白血病、前列腺癌及胃癌等中，均发现p53的缺失或突变伴随有miR-34a表达水平的下调［9-10］。在前期工作中，我们采用Agilent公司的Human miRNA V16.0芯片，检测EGCG对CNE-2 Z细胞中miRNA表达谱的影响，发现miR-34a表达是明显上调的。采用实时定量PCR进行验证也显示，EGCG可上调CNE-2Z细胞中miR-34a的表达，呈剂量依赖性。同时，本研究也发现，随着EGCG浓度增加，P53蛋白的表达也明显增高，这可能与EGCG调控P53蛋白稳定性增强进而上调P53表达有关［11］。这些结果提示，EGCG可能通过促进P53/miR-34a表达调控鼻咽癌CNE-2Z细胞G1期阻滞，并诱导细胞凋亡，但其确切的交互关系尚需进一步研究阐明。

Notch1是Notch基因编码的蛋白家族成员之一，它是一种跨膜受体蛋白，通过与相应的配体结合在多种细胞分化发育中起重要的调控作用［12］。近年来研究发现，Notch1信号传导异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。在一些肿瘤中如胶质瘤、胰腺癌和结直肠癌中，Notch1被认为作为癌基因起作用，通过影响细胞周期相关蛋白如cyclin D1、cyclin E、CDK2、p27等参与细胞周期调控，进而促进细胞增殖［13-14］。通过生物信息学软件预测发现，miR-34a与Notch1 的3'UTR高度同源配对，萤光素酶实验也证实了miR-34a对Notch1基因的直接调控作用［15］。我们应用不同浓度的EGCG处理鼻咽癌CNE-2Z细胞后，发现与对照组相比，Notch1的mRNA和蛋白表达水平均是明显下降的，呈剂量依赖关系，这就提示EGCG可能通过降低Notch1表达抑制鼻咽癌细胞的增殖，而其作用机制可能与EGCG上调P53/miR-34a有关。但亦有研究显示Notch1与P53之间存在直接相互关系，Notch1通过影响P53蛋白稳定性进而抑制P53介导的细胞凋亡反应［16］。

Figure 5.The effect of EGCG on the expression of P53 in the CNE-2Z cells by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.图5 EGCG对CNE-2Z细胞P53表达的影响

Figure 6.The effect of EGCG on the expression of miR-34a in the CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.图6 EGCG对CNE-2Z细胞miR-34a表达的影响

Figure 7.The effect of EGCG on the expression of Notch1 atmRNA and protein levels in the CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.图7 EGCG对CNE-2Z细胞Notch1 mRNA和蛋白表达的影响

综上所述，EGCG可能通过调控P53/miR-34a/Notch1通路诱导鼻咽癌细胞周期阻滞，抑制细胞增殖，将为EGCG在鼻咽癌防治中的应用提供理论依据。

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(责任编辑:林白霜，罗森)

Inhibitory role of epigallocatechin-3-gallate in proliferation of human nasopharyngeal carcinoma cells by targeting P53/miR-34a

LI Bin-bin1，2，WAN Zheng2，KONG Xia1，LIAO Dan1，WANG Zi-you1，HUANG Guoliang2
(1Department of Pathophysiology，2Key Laboratory for Medical Diagnostics of Guangdong Province，Guangdong Medical College，Dongguan 523808，China.E-mail: 44775879@qq.com)

［ABSTRACT］AIM: To study the effect of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells，and to explore its mechanism by targeting miR-34a.METHODS: Nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells were treated with various concentrations of EGCG.The ability of cell proliferation was detected by CCK-8 assay，5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) incorporation assay and colony-forming assay.The cell cycle distributions were analyzed by flow cytometry.The protein levels of P53 and Notch1 were detected by Western blot.The expression of miR-34a and Notch1 mRNA was measured by real-time PCR.RESULTS: EGCG effectively inhibited the proliferation and colony formation of CNE-2Z cells in a dose-dependent manner，which was related to its induction of cell cycle arrest at G0/G1phase.The expression of P53 and miR-34a in CNE-2Z cells was significantly increased after treated with EGCG，while the expression of Notch1 at mRNA and protein levels was markedly suppressed.CONCLUSION: EGCG induces cell cycle arrest and suppresses cell proliferation by regulating the P53/miR-34a/Notch1 pathway in NPC cells.

［KEY WORDS］Epigallocatechin-3-gallate; Nasopharyngeal carcinoma; P53; MicroRNA-34a; Notch1

*［基金项目］广东省建设中医药强省科研课题(No.20121111)

［收稿日期］2015-03-17

［文章编号］1000-4718(2015)09-1557-06

［中图分类号］R739.6; R730.23

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.004