抗疟中草药筛选及其有效部位研究

周泽琴，张雄飞，胡梁及，蔡 兴，钟娜娜，朱盛山

(广东药学院 中药开发研究所，广东 广州 510006)



抗疟中草药筛选及其有效部位研究

周泽琴，张雄飞，胡梁及，蔡 兴，钟娜娜，朱盛山*

(广东药学院 中药开发研究所，广东 广州 510006)

目的：为寻找新的有效抗疟药物提供实验依据。方法：建立伯氏疟原虫鼠疟实验模型，比较常山复方、金牛草、山豆根、鹅不食草、常山、仙鹤草、青蒿等药物的50%醇提取物抗疟活性，比较抗疟活性最强醇提取物中不同萃取部位对疟原虫的抑制效果。结果：常山复方的50%醇提取物疟原虫抑制率为83.46%，高于青蒿药材的67.33%，抗疟效果比较差异具有统计学意义(P<0.05)；常山复方的50%醇提取物乙酸乙酯萃取部位对疟原虫的抑制率达93.78%，与青蒿素的95.92%接近。结论：常山复方乙酸乙酯萃取物具有显著的抗疟活性，可作为抗击疟疾的候选药物。

抗疟；常山复方；伯氏疟原虫；抑制率

自上世纪50年代开始，常山具有抗疟效果已有报道[1-2]。解放初期，由于奎宁系列抗疟药物供不应求、价格昂贵等原因，常山作为抗疟代用药物开始在临床使用，并取得了良好效果。例如，湖北省麻城县的352 100例疟疾患者服用常山药物，治疗后普查复发率仅为0.004 8%[3]。中医认为，疟疾乃肝脾同病，需肝脾同治[4-5]。本文选用常山复方，以常山截疟为主，辅以柴胡等中草药疏肝散瘀，养风木、培中土，共复健运之本。大量研究报道[6-7]表明，仙鹤草主要抗疟活性物质为脂溶性酚类成分。湖南省宁乡县卫生院以金牛草煎剂对抗疟疾，效果显著[8]。许昌地区五十一种中草药抗鼠疟实验报告显示，山豆根、鹅不食草等中草药醇提物具有显著的抗疟活性[9]。本研究以伯氏疟原虫感染小鼠为动物模型，针对各地报道的抗疟单方、验方和民间草药进行抗疟活性评价，为寻找新的抗疟药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级昆明小鼠(许可证号：syxk-粤2013-0020)，标准体重(20±2)g，共86只，雌雄各半，由广州中医药大学实验动物中心提供。

1.2 鼠疟原虫

伯氏疟原虫虫株K173(Plasmodium berghei k173,P.b.k173)，由广州中医药大学科技园提供。

1.3 试剂及仪器

青蒿素Artemisinin,ART(广州汉方现代中药研究开发有限公司，批号：100651，含量：100.3%)；蒸馏水、吉氏染液、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、乙醇等均为分析纯。

光学显微镜(B205，重庆奥特光学仪器有限公司)、电子天平(BT211B，德国Sartorius公司)、载玻片、细胞计数板、手掀计数器、注射器、载玻片、剪刀、镊子等。

1.4 样品制备

1.4.1 青蒿素溶液制备 精密称取青嵩素15.5mg,置于研钵内研磨成细粉末状,加入0.5%的羧甲基纤维素钠生理盐水5mL,继续研磨,制成浓度为1.24mg/0.4mL的药液，置4℃冰箱冷藏备用。

1.4.2 中草药提取物 分别取常山复方、金牛草、山豆根、鹅不食草、常山、仙鹤草、青蒿各500g，粉碎，过筛，以10倍量50%的乙醇提取2次,每次1h，减压回收乙醇，浓缩至稠膏，得粗提物；将常山复方粗提物与蒸馏水混悬，依次用乙酸乙酯、石油醚、氯仿、正丁醇萃取至有机层无色，回收有机溶剂，冷冻干燥，得到常山复方的乙酸乙酯提取物、石油醚提取物、三氯甲烷提取物、正丁醇提取物，各提取部位密封置4℃冰箱冷藏备用，临用前用0.5%的羧甲基纤维素钠稀释至所需浓度。

1.5 伯氏疟原虫鼠疟模型建立

取伯氏疟原虫常规株，复苏后接种3只健康小鼠,每只腹腔注射0.2mL感染血液,作为血传第一代；接种后5天，血传3只健康小鼠，作为血传第二代；接种后5天,将待试验小鼠称重随机分组，雌雄各半，并分别血传接种试验小鼠,即为伯氏疟原虫常规鼠疟模型[10]。

1.6 分组及给药方法

将78只已感染疟原虫小鼠随机分为13组，每组6只，分别为模型组、青蒿素对照组、常山醇提物用药组、金牛草醇提物用药组、鹅不食草醇提物用药组、山豆根醇提物用药组、仙鹤草醇提物用药组、青蒿醇提物用药组、常山复方醇提物用药组、常山复方三氯甲烷萃取物用药组、常山复方正丁醇萃取物用药组、常山复方乙酸乙酯萃取物用药组、常山复方石油醚萃取物用药组。用药组小鼠给予相应中药材醇提物饲养，模型组给予等体积生理盐水。3～4h后按1.365g/kg标准灌胃给首剂药，连续给药4天。

1.7 制片与镜检

于小鼠尾部取约1μL的血量，制血膜，编号。甲醇固定，待干后用吉氏染液染色25min，清水细流冲洗干净、晾干。镜检50个油镜视野(相当于2×104红细胞(RBC))未见原虫者为阴性；原虫感染率<1%，计算104个RBC；感染率1%～10%，计算103个RBC；感染率10%以上，计算500个RBC。通过油镜计算红细胞感染疟原虫的百分数、感染率及抑制率，计算公式如下：

感染率=(感染红细胞数/红细胞总数)×100%

抑制率=(模型组RBC感染率-用药组平均RBC感染率)/模型组RBC感染率×100%

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 不同中草药醇提物抗疟效果比较

在选取的7种药物中，以常山复方醇提物用药组抗疟效果最佳，对感染伯氏疟原虫小鼠的红细胞抑制率可达83.46%，青蒿、常山及仙鹤草用药组分别为67.33%、65.76%、65.03%，山豆根、金牛草、鹅不食用药组抗疟效果相当，为55%～60%。与模型组比较，7种药材用药组均有显著的抗疟活性(P<0.05)；常山复方抗疟效果优于青蒿用药组，差异具有统计学意义(P<0.05)；常山用药组与青蒿用药组抗疟效果无显著性差异(P>0.05)；金牛草、鹅不食草、山豆根、仙鹤草等用药组抗疟效果均低于青蒿用药组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同中草药醇提物抗疟效果比较 ±s，n=6)

注：与模型组比较，*P<0.05；与青蒿醇提物对照组比较，▲P<0.05。

2.2 常山复方提取物不同提取部位抗疟效果比较

在上述实验基础上，选取抗疟效果最佳的常山复方进一步筛选抗疟有效部位。与模型组比较，常山复方的乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、三氯甲烷提取物、石油醚提取物用药组均有显著的抗疟活性(P<0.05)。其中，乙酸乙酯提取物对感染伯氏疟原虫小鼠红细胞抑制率达93.78%，仅略低于青蒿素对照组的95.92%，明显优于正丁醇提取物、三氯甲烷提取物、石油醚提取物用药组，其他三组提取物抑制率分别为70.99%、62.30%、18.95%，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 常山复方提取物不同提取部位抗疟效果比较 ±s，n=6)

注：与模型组比较，*P<0.05。

2.3 不同药物对小鼠感染疟原虫红细胞的影响

被疟原虫寄生的红细胞出现胀大，甚至形变，胞质致密，色深蓝，几乎充满被寄生的红细胞内，棕褐色疟色素散在。在光学显微镜油镜视野下，被疟原虫感染的红细胞数量从小到大依次为青蒿素对照组、常山复方乙酸乙酯萃取物用药组、常山复方醇提物用药组、常山醇提物用药组、模型对照组。见图1。

图1 不同药物对小鼠感染疟原虫红细胞的影响

3 讨论

目前，我国青蒿产量少,且青蒿素含量低,青蒿素类药物的商品价格较高。在疟疾高发的非洲地区，大部分国家经济、医疗卫生水平普遍较低,多数疟疾患者可应用青蒿素类药物的概率依然较小,全球抗疟形势仍不容乐观[11]。在选取的7种抗疟药物中，以常山复方抗疟效果最佳，青蒿、常山次之，金牛草、鹅不食草、山豆根、仙鹤草效果较差。其中，常山复方的乙酸乙酯提取部位抗疟效果最优。据记载，常山有截疟劫痰之效，可用于解热、抗阿米巴、除痰、疟疾等[3，12]。本实验证实常山抗疟效果明显，但以常山为主的复方抗疟效果更佳，优于青蒿药材；且常山复方的乙酸乙酯萃取部位抗疟效果与青蒿素相当。在青蒿素耐药性日益显现、价格高居不下的情况下，寻找常山复方药材提取物的抗疟活性成分，阐明其作用机制，应用前景较大。

[1] 赵承嘏,谢毓元.常山叶中之抗疟质素[J].中国科学,1951(4):455-457.

[2] 村田清志.常山的抗疟作用[J]. 国外医学·中医中药分册,1998,20(5):61-62.

[3] 中共湖北省委除害灭病办公室.使用中药常山抗疟的经验[J]. 中医杂志,1959,1(4):35-37.

[4] 柳宝怡．柳宝怡医案[M].北京:人民卫生出版社,1981:57.

[5] 柳宝怡．增评柳选四家医案[M].南京:江苏科学技术出版社,1983:272.

[6] 洪阁,戴永红,刘培勋,等.仙鹤草化学成分和药理作用研究进展[J].药学服务与研究,2008,8(5):362-366.

[7] 黄兰孙.廿年来抗疟药物化学研究进展(续)[J].药学学报,1983,20(8):633-639.

[8] 宋大仁.介绍几种防治疟疾的速效疗法[J].江西中医药,1959,8(8):17-19.

[9] 王顺祥,陈松枝,韩勇,等.许昌地区五十一种中草药抗鼠疟实验初步报告[J].河南预防医学杂志,1980,8(4):12-19.

[10] 孙雪英. 复方蒿甲醚对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟疗效与其它抗疟药疗效比较的研究[D].成都:成都中医药大学,2013.

[11] 王顺祥,李书迠. 抗疟中草药青蒿的研究[J].河南预防医学杂志,1978,6(2):20-29.

[12] 赵灿熙. 常山提取物对氯喹敏感株和抗氯喹株鼠疟原虫的效应观察[J]. 同济医科大学学报, 1986(2):129-132.

(责任编辑：李岚春)

Screen The Antimalarial Chinese Medicinal Herb and Research its Effective Parts

Zhou Zeqin，Zhang Xiongfei，Hu Liangji，Cai Xing，Zhong Nana，Zhu Shengshan*

(Research and Development Institute of Chinese Materia Medica, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

Objective:For finding new, effective antimalarial medicines and provide experimental bases.Methods:The experimental models were established by mice infected with Plasmodium berghei. Compare the antimalarial activity of 50% ethanol extracts of compound Dichroa febrifuga Lour，Polygala arvensis Willd，Radix Sophorae Subprostratae，Centipeda minima，Dichroa febrifuga Lour，Agrimonia pilosa，Artemisia apiacea. Picked out the highest reactive ethanol extracts :compound Dichroa febrifuga Lour. Then, compare the suppression effect on plasmodium from its different extractive fractions.Results:The plasmodium inhibition of 50% ethanol extracts of compound Dichroa febrifuga Lour and Artemisia apiacea were 83.46% and 67.33%, respectively , which had statistical significance (P< 0.05); The plasmodium inhibition of ethyl acetate extracts of compound Dichroa febrifuga Lour was 93.78% and artemisinin was 95.92%.Conclusion:The ethyl acetate extracts of compound Dichroa febrifuga Lour has significant antimalarial activity,which could be the new candidate antimalarial medicines as a priority.

Antimalarial;Compound Dichroa Febrifuga Lour; Plasmodiumberghei;Inhibition

2015-05-05

周泽琴(1990-)，女 ，广东药学院硕士研究生，研究方向为传统中药现代化。E-mail: m18826413913@163.com

朱盛山(1957-)，男，广东药学院教授，硕士生导师，研究方向为传统中药现代化。E-mail: zhush3@126.com

R289

A

1673-2197(2015)16-0006-03

10.11954/ytctyy.201516004