海拔高度对重庆产桔梗皂苷含量的影响

黄 娇，姜登军

(1.重庆三峡医药高等专科学校，重庆 404120；2.重庆万州食品药品检验所，重庆 404100)



海拔高度对重庆产桔梗皂苷含量的影响

黄 娇1，姜登军2

(1.重庆三峡医药高等专科学校，重庆 404120；2.重庆万州食品药品检验所，重庆 404100)

目的：探讨海拔高度对重庆产桔梗中皂苷含量的影响。方法：采用UV定量测定桔梗中总皂苷和桔梗皂苷D、D2、去芹菜糖桔梗皂苷D的含量，采用手持 GPS 进行测定海拔高度。运用SPSS19.0软件对海拔高度与4个有效成分含量进行相关性分析。结果：重庆产桔梗中皂苷的含量随着海拔的升高而增加，采样区域海拔高度与对应桔梗中皂苷D、D2、去芹菜糖桔梗皂苷D、总皂苷含量的相关系数分别为r1=0.988(P1=0.012)，r2=0.987(P2=0.011)，r3=0.996(P3=0.004)，r4=0.960(P4=0.04)，表明海拔高度与桔梗皂苷的含量有相关性。结论：桔梗皂苷的含量与其生长海拔高度有关，为重庆产桔梗的科学种植提供理论依据。

桔梗；海拔高度；皂苷含量；UV；HPLC-ELSD

桔梗(Radix platycodi)为桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.) A. DC.的干燥根，在我国药用历史悠久[1]。桔梗可药食两用，主要用于治疗咳嗽痰多、胸闷不畅、咽痛、音哑、肺痈吐痰、疮疡脓成不溃等证[2]。近年来海内外学者对桔梗中多种成分，特别是三萜皂苷类成分的药理活性进行了较多研究[3-5]。桔梗的主要化学成分为齐墩果酸型五环三萜皂苷、桔梗皂苷A、桔梗皂苷B、桔梗皂苷D[6]等，其中桔梗皂苷 D为桔梗皂苷的主要成分[7]，药典用其作为定量测定的主要指标。目前文献多研究不同产地桔梗皂苷的含量测定，但还未见关于海拔高度对桔梗皂苷含量的影响研究[8-10]。重庆地处西南，地形异常复杂，从丘陵、平原到高山，海拔高差大，生态环境呈现多样性，立体气候明显。三峡库区的桔梗种植产区海拔高度相差悬殊，桔梗药材质量也存在着一定差异。为更科学合理有效地利用该药材，本试验以桔梗为试验材料，以总皂苷和3种桔梗皂苷的含量为评价指标，测定重庆不同海拔桔梗中皂苷的含量，探讨海拔对桔梗药材质量的影响，为其质量评价及科学栽培提供实验依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

紫外-可见分光光度计(岛津UV-2401) ；98-1-B电子调温电热套( 天津市泰斯特仪器有限公司) ；MH-2000 调温型电热套( 北京科伟永兴仪器有限公司) ；ME215S十万分之一电子天平( 梅特勒-托利多仪器( 上海)有限公司) ；CP224S万分之一电子天平 ( 梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；集思宝G130坐标定位仪GPS( 北京合众思壮科技股份有限公司) ；岛津LC-20A高效液相色谱仪，ELSD-LTII检测器，岛津工作站；SD3200超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司) ；LK-COOA摇摆式高速中药粉碎机。

1.2 试剂

桔梗皂苷D标准品(批号：111851-201204)，购自中国食品药品检定研究院；去芹菜糖桔梗皂苷D标准品(批号：Must-14050901)，购自成都曼思特生物科技公司；桔梗皂苷D2标准品(批号：YL2013112507)，购自上海一林生物科技公司；乙腈为色谱纯，甲醇、乙醇、正丁醇、甲酸、冰醋酸、高氯酸、香草醛为分析纯(川东化工集团有限公司化学试剂厂)；超纯水 (自制)。

本实验桔梗样品于2013年10月采自万州老土村，分别于不同海拔高度(500～1 150m)的阳坡和阴坡采样，共20批。采集药材后清洗去除泥沙，刮去根皮后干燥，即得桔梗样品，并经重庆万州食品药品检验所孟家安教授鉴定为桔梗科桔梗属植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A. DC. 的根。

2 方法与结果

2.1 桔梗总皂苷含量测定方法[11]

精密称定桔梗皂苷D 5.65mg，加甲醇溶解并稀释制成浓度为0.565mg·mL-1的标准品溶液。精密吸取100～1 000μL标准品溶液，分别置于10mL具塞磨口试管中，于70℃水浴蒸发至干，精密加入5%香草醛-冰醋酸0.2mL，高氯酸0.8mL，摇匀，于60℃水浴中加热15min，冰水浴中冷却3min，加冰醋酸5mL，随行试剂作空白。于岛津UV-2401紫外-可见分光光度计473nm波长处测定吸收度并建立标准回归方程：Y=1.789X+0.012，R=0.999。

精密称取已干燥桔梗药材粉末1.0g，准确加入8倍量70%乙醇，回流提取3次，每次1.5h，合并滤液，水浴蒸发至干。浸膏加水5mL溶解，所得溶液缓缓通过已处理好的D-101树脂柱(径高比 1∶5)，以100mL水洗脱，弃去水液，再以60mL 70%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，用20mL水溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3 次，每次20mL。合并正丁醇液，减压蒸干，残留物加甲醇溶解定容于10mL 容量瓶中，摇匀，备用。吸取200μL，于岛津UV-2401紫外-可见分光光度计473nm波长处测定吸收度，计算总皂苷含量。

2.2 3种桔梗皂苷含量测定

2.2.1 色谱条件 桔梗皂苷D测定条件：色谱柱：Kinetex C18色谱柱(4.6mm×100mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，流速：0.4mL·min-1；进样量：20μL。梯度洗脱程序如下：0.01～10min，20%A；10～54min，33%A；54～66min，4%A。桔梗皂苷D2测定条件：色谱柱：Kinetex C18色谱柱(4.6mm×100mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，流速：0.8mL·min-1；进样量：20μL。梯度洗脱程序如下：0.01～10min，25%A；10～54min，39%A；54～66min，4%A。去芹菜糖桔梗皂苷D测定条件：色谱柱：KinetexC18色谱柱(4.6mm×100mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.01%磷酸溶液(B)，流速：1.0mL·min-1；进样量：20μL。梯度洗脱程序如下：0.01～1min，23%A；10～50min，15%A；54～66min，4%A。

2.2.2 标准品溶液制备 精密称定桔梗皂苷D标准品5.65mg、去芹菜糖桔梗皂苷D 5.01mg、桔梗皂苷D23.51mg，分别置于10mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，经0.45μm微孔滤膜滤过即得，进样20μL。3种桔梗皂苷的对照品和样品色谱见图1。

2.2.3 供试品溶液制备[12]精密称定各桔梗药材粉末(过二号筛)2g，置于锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，在500W功率下超声提取30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足重量，滤过，取续滤液，经0.45μm微孔滤膜滤过即得。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取标准品溶液1、5、10、15、20、25μL注入液相色谱仪。按照“2.2.1”项下色谱条件，测得桔梗皂苷D、去芹菜糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2峰面积积分值，以标准品溶液进样量的自然对数为横坐标(X)，峰面积积分值的自然对数为纵坐标(Y)进行线性回归，得到桔梗皂苷D、去芹菜桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2的线性回归方程分别为：Y=0.985x+11.886，r2=0.999 2；Y=0.999x+12.121，r2=0.999 8；Y=0.992x+11.88，r2=0.999 9；表明桔梗皂苷D、去芹菜糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2分别在0.563～14.075μg、0.452～11.208μg、0.344～8.600μg进样量范围内与峰面积积分呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 取供试品溶液重复进样5次，每次20μL，计算桔梗皂苷D、去芹菜桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2的峰面积RSD分别为1.26%、1.87%、1.56%，表明该方法精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12、24h后进样20μL，桔梗皂苷D、去芹菜桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2的峰面积RSD分别为0.93%、2.07%和0.87%，表明样品溶液在24h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一批药材，按照“2.2.3”项下制备6份供试品溶液，依照相同色谱条件测定桔梗皂苷D、去芹菜桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2的含量平均值分别为0.58%、0.30%和0.34%，RSD分别为2.83%、2.01%和2.01%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称定2g桔梗药材粉末5份(桔梗皂苷D、去芹菜桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2含量分别为0.58%、0.30%和0.35%)，分别精确加入桔梗皂苷D标准品1mL(含桔梗皂苷D 0.563mg)、去芹菜桔梗皂苷D标准品1mL(含去芹菜桔梗皂苷D 0.452mg)和桔梗皂苷D2，标准品1mL(含桔梗皂苷D20.344mg)，按供试品制备方法处理，计算回收率。桔梗皂苷D、D2、去芹菜桔梗皂苷D样品的平均回收率分别为99.58%、99.92和101.3%，RSD分别为1.09%、1.62%和1.32%，表明该法的回收率符合要求。

2.2.9 样品测定 分别称取不同海拔高度的桔梗药材，按照“2.2.3”项下方法制备样品溶液，精密吸取供试品溶液20μL，注入色谱仪，测定结果见表1。

图1 3种皂苷标准品HPLC色谱

2.3 数据统计及相关性分析

运用统计学软件SPSS19.0，对采样区域海拔高度与对应药材所测总皂苷和3种皂苷D的含量进行相关性分析。采样区域海拔高度与对应药材桔梗皂苷D含量相关系数为r1=0.988，P1= 0.012(双侧)<0.05，说明两者之间有显著性差异；海拔高度与对应药材桔梗皂苷D2含量相关系数为r2=0.987，P2=0.011(双侧)<0.05，说明两者之间有显著性差异；海拔高度与对应药材去芹菜糖桔梗皂苷D含量相关系数为r3=0.996，P3=0.004(双侧)<0.01，说明两者之间有显著性差异；海拔高度与对应药材总皂苷含量相关系数为r4=0.960，P4=0.04(双侧)<0.05，说明两者之间有显著性差异。结果表明，海拔对桔梗皂苷的含量有直接影响。

3 讨论

三萜皂苷是桔梗的主要活性与特征性成分[3]。植物生存环境中的生态因子可分为生物因子和非生物因子，海拔高度属于地形因子，是非生物因子的一种[13]。为更好地指导重庆桔梗药材的科学栽培，本实验采用同一采收期、不同海拔高度的桔梗作为实验材料，探讨海拔高度对桔梗中皂苷类成分含量的影响。实验结果表明，重庆万州桔梗总皂苷和桔梗皂苷D、D2、去芹菜糖桔梗皂苷D的含量从500～1 100m呈现上升趋势，与采样区域海拔高度呈正相关性。

表1 桔梗皂苷含量测定 (%)

三萜皂苷类化合物是植物体内重要的次生代谢物，其含量和组成随着植物遗传背景、组织类型、生长年龄、生理状况以及环境因子的变化而发生显著变化，最终取决于三萜皂苷合成途径中的一些关键酶及其在细胞中的表达水平。鲨烯是三萜皂苷类的前体物质，皂苷类化合物合成的关键酶包括β-香树脂合酶(β-AS)、 P450 和 GT 酶，均为光诱导酶，即在光的存在下，酶活性迅速升高。GT 酶的活性还与温度有关，温度过低可影响合成酶活性，进而影响皂苷的生物合成。光强度较大时三萜皂苷的合成较为旺盛，植物体内的光反应与电子传递需要光能激发，光反应产物是参与初生代谢和次生代谢的必需物质[13-14,18-19]。桔梗是喜光植物，不同海拔高度的日照、温度均有所差异，从而影响桔梗皂苷的生物合成及代谢。本研究结果符合相关文献研究结果[15-17]。

重庆产桔梗皂苷成分的含量分布趋势可能与其所处的特殊地理环境有关，三峡库区沟壑纵横，昼夜温差大，同一纬度不同高度的气温及日照变化明显，从而影响桔梗皂苷的生物合成。当然，影响桔梗生长发育以及体内皂苷类成分积累的因素比较复杂，可能是多种生态因子，如雨量、土壤肥力、温度等协同作用的结果。在海拔1 100m 以上是否也存在海拔高度与桔梗皂苷含量的正相关性，仍需采集更多的样本进行研究，后续将对影响桔梗次生代谢产物积累的关键生态环境因子进行深入研究。

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(责任编辑：尹晨茹)

The Effect of Altitude on Saponin Content of Platycodon grandiflorum in Chongqing

Huang Jiao1,Jiang Dengjun2

(1.ChongQing Three Gorges Medical College,Chongqing 404120,China; 2.ChongQing wanzhou institute for Food and Drug Control,Chongqing 404100,China)

Objective:To investigate the effect of altitude of Platycodon grandiflorum saponin content in Chongqing.Methods:The contents of total saponins and Platycodin D、Platycodin D2、Deapio-platycodin D were determined by UV and HPLC-ELSD,altitude using portable GPS determination. Correlation analysis of altitude and 4 effective ingredient content by SPSS 19.0.Results:The contents of platycodin increased with the increased of altitude in Chongqing,the sampling area altitude and the content of Platycodin D、Platycodin D2、Deapio-platycodin D and total saponins correlations werer1=0.988(P1=0.012)，r2=0.987(P2=0.011)，r3=0.996(P3=0.004)，r4=0.960(P4=0.04),the results show that the contents of platycodin was related to the altitude. Conclusion:The contents of platycodin was related to altitude,can be as the theoretical basis of Platycodon grandiflorum provides scientific planting produced in Chongqing.

Radix platycodi;Altitude;Saponin Content;UV;HPLC-ELSD

2015-04-08

重庆市教委科学技术研究项目(K131801)；重庆市科技攻关项目(CSTC,2011AC5062)

黄娇(1982-)，女，重庆三峡医药高等专科学校讲师，研究方向为中药质量评价。

R284.1

A

1673-2197(2015)16-0030-04

10.11954/ytctyy.201516014