湖北产葛根药材及提取物指纹图谱分析

刘慧敏，徐惠芳，邵贝贝(.武汉市中医医院 药学部，湖北 武汉43000；武汉联合药业，湖北 武汉4300)



湖北产葛根药材及提取物指纹图谱分析

刘慧敏1，徐惠芳1，邵贝贝2
(1.武汉市中医医院 药学部，湖北 武汉430010；2武汉联合药业，湖北 武汉430011)

目的：建立湖北产葛根药材及提取物的指纹图谱检测方法，为确保葛根药材、提取物及其制剂的内在质量提供依据。方法：采用TIANHE Kormasil C18柱；流动相A：甲醇，流动相B：1%醋酸溶液；流速1.0mL·min-1；检测波长为250nm；柱温为35℃。梯度洗脱程序：0～10min 22%A，10～40min 22%～45%A， 40～45min 45%A。对湖北省十堰竹溪、恩施州和黄冈罗田三个产地的葛根药材及提取物进行指纹图谱研究。结果：湖北省三个产地葛根药材及提取物的指纹图谱基本一致。结论：湖北三个产地的葛根药材质量差异不大。葛根药材、提取物相关性良好，各产地指纹图谱基本一致，制备工艺稳定可行。

葛根药材；葛根提取物；指纹图谱；质量控制

葛根为我国常用中药，始载于《神农本草经》，为豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.) Ohwi的干燥根[1]。葛根性凉、气平、味甘，主要含异黄酮成分葛根素、葛根素木糖苷、大豆苷、大豆苷元及β-谷甾醇、花生酸等多种生理活性物质，尤以葛根素含量最高[2, 3]。葛根素具有解肌退热、透发麻疹、生津止渴、升阳止泻、通经活络、解酒毒等功效[4]，临床上主要用于治疗外感发热头痛、颈项强痛、口渴、麻疹不透、热痢、泄泻、眩晕头痛、中风偏瘫、酒毒伤中等症[5, 6]。现代医学研究表明葛根中的异黄酮类化合物葛根素对高血压、高血脂、高血糖和心脑血管疾病有很好的疗效[7, 8]。

葛根喜生长于山坡草丛中或路旁及疏林中较阴湿的地方。我国的葛根资源主要分布在陕西、湖北、四川[9]和安徽等地[10-12]，其中湖北为葛根产量最大的省市之一。湖北葛根资源主要集中在十堰市、黄冈市、恩施州，被广泛用于食品和医药等行业[13]。由于不同产地的葛根药材外形相似，在市场流通和使用阶段存在混杂现象，目前对葛根的质量控制主要是检测葛根素的含量[1]，单一指标难以反映中药多成分、多靶点的特点[14]。为了更有效地控制葛根质量，葛根指纹图谱的研究逐渐增多[15-19]。本实验采用高效液相色谱法对湖北产葛根药材及不同产地药材相同工艺的提取物进行了指纹图谱研究[20]，为确保葛根药材、提取物及其制剂的内在质量提供参考依据。

1 仪器和材料

岛津LC-20AT液相色谱仪(包括LC-20AT色谱泵, SPD-20A紫外检测器),SP-756(PC)型紫外可见分光光度计(Spectrum shanghai),HPD200A型大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，15mm×500mm 的玻璃柱。

葛根对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110752-200912，供含量测定用),冰乙酸(北京化工厂，批号：20080708)，甲醇为色谱级，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

葛根药材3批，分别采购于湖北省的十堰竹溪、恩施州和黄冈罗田，经武汉市中医医院药学部鉴定为豆科植物野葛。

自制葛根提取物3批：3批药材分别加10倍量水，提取3次，每次1.5h；60%乙醇提取24h，回收溶剂，得干膏。提取物干膏中葛根素和总黄酮含量分别为(12.08%±0.56%)和(31.42%±0.12%)。

自制葛根纯化物3批：将自制提取物用HPD200A大孔树脂纯化，收集30%乙醇洗脱液，回收溶剂，得干膏。纯化物干膏中葛根素和总黄酮含量分别为(32.40%±0.47%)和(75.52%±0.19%)。

2 色谱条件

TIANHE Kormasil C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相A：甲醇，流动相B：1%醋酸溶液；流速1.0mL·min-1；检测波长为250nm；柱温为35℃。梯度洗脱程序：0～10min 22%A，10～40min 22%～45%A， 40～45min 45%A。

3 方法

3.1 对照品溶液制备

精密称取葛根素对照品10.40mg于5 mL容量瓶中，无水乙醇定容，再取1mL于25mL容量瓶中定容，得浓度为83.2μg·mL-1的对照品溶液。

3.2 供试品溶液制备

药材：葛根素含量测定按照2010版《中国药典》(一部)方法，取葛根饮片，粉碎，过50目筛备用。精密称取葛根粉末0.1g于烧瓶中，精密加入30%乙醇50mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液10μL进样。

提取物：取自制葛根提取物的干膏，加 30%乙醇溶解稀释，过滤，取续滤液，进样。

纯化物：取自制葛根纯化物的干膏，加30%乙醇溶解稀释，过滤，取续滤液，进样。

3.3 测定方法

分别精密吸取对照品溶液和药材的供试品溶液10μL， 在色谱条件下分析，对照品色谱见图1，药材供试品色谱见图2。

4 方法学考察

精密称取葛根素对照品适量，用流动相溶解并稀释为5.32、10.63、21.26、63.78、85.04、106.30μg·mL-1的对照品溶液，准确量取各溶液10μL进样。以样品的峰面积(A)和对照品溶液质量浓度(C)，应用最小二乘法线性回归处理后得方程为A=47 257C+2 524.2，r=0.999 9，表明在质量浓度为5.32～106.30μg·mL-1范围内线性关系良好，符合试验要求。

图1 葛根素对照品HPLC图谱

葛根素乙醇溶液低、中、高浓度(21.26，53.15，85.04μg·mL-1)精密度的RSD分别为0.11 %、0.18 %、0.27 %，符合要求。

5 结果

5.1 共有峰标定

湖北省三个产地葛根的提取物和纯化物分别在色谱条件下测得HPLC图谱，在《指纹图谱相似度软件药典2004A版》下处理，得到葛根提取物和纯化物的HPLC对照图谱(提取物：图3中R、纯化物：图4中R)。 以R为对照图谱，计算湖北省三个产地葛根提取物和纯化物在同一保留时间的相对峰面积值。结果见表1、表2。叠加色谱峰见图3、图4。

a：湖北十堰；b：湖北恩施；c：湖北黄冈

表1 三个产地(十堰、恩施、黄冈)葛根提取物共有峰相对面积

由上述可知，湖北省不同产地葛根药材提取物和纯化物指纹图谱比较，结果表明：十堰、恩施和黄冈三个产地的葛根药材提取物共有峰有 19个，三个产地葛根药材纯化物的共有峰也有11个，各个峰的信噪比都在10 以上且共有峰面积之和大于总峰面积的90%。

5.2 相似度比较

利用国家药典委员会相似度计算软件《指纹图谱相似度软件药典2004B版》，使用相关系数法计算，对所得的葛根药材提取物和纯化物HPLC指纹图谱全谱进行相似度计算。以相关系数表征相似度，结果见表3、表4。

表2 三个产地(十堰、恩施、黄冈)葛根纯化物共有峰相对面积

表3 湖北三个产地葛根提取物相似度比较

注：R为对照图谱，S1、S2、S3为十堰、恩施和黄冈的葛根样品。

表4 湖北三个产地葛根纯化物相似度比较

注：R为对照图谱，S1、S2、S3为十堰、恩施和黄冈的葛根样品。

表3和表4表明，湖北省十堰、恩施和黄冈三个产地野葛药材的提取物和纯化物都很匹配，与对照指纹图谱的相似度均能达到90% 以上。

6 结语

湖北省葛根资源丰富，本实验首次对湖北产葛根药材进行了指纹图谱研究，对流动相的筛选考察了甲醇—水(22∶78)，甲醇-水(梯度洗脱)，甲醇-1%醋酸(22∶78)，甲醇-1%醋酸(25∶75)，甲醇-1%醋酸(梯度洗脱)等，最终确定了流动相A为甲醇，流动相B为1%醋酸溶液，流速1.0mL·min-1,检测波长250nm，柱温为35℃。梯度洗脱程序：0～10min 22%A，10～40min 22%～45%A， 40～45min 45%A的色谱分离条件，得到了分离度较好的指纹图谱。

图3 湖北三个产地葛根提取物HPLC图谱

注：R为对照图谱， S1、S2、S3为十堰、恩施和黄冈的葛根样品。

图4 湖北三个产地葛根纯化物HPLC图谱

注：R为对照图谱， S1、S2、S3为十堰、恩施和黄冈的葛根样品。

通过对比湖北三个主要产地十堰、恩施和黄冈的葛根药材及提取物的指纹图谱，结果表明三个产地的葛根药材提取物共有峰有 19个，三个产地葛根药材纯化物的共有峰有11个，各个峰的信噪比都在10 以上且共有峰面积之和大于总峰面积的90%，表明这三个产地葛根药材的活性成分种类含量基本一致。

不同产地的葛根药材在相同的工艺条件下进行提取和纯化处理，得到的葛根素和总黄酮含量基本一致，且相同工艺条件下不同产地的葛根提取物和纯化物的指纹图谱相似度均能达到90%以上，说明该制备工艺对湖北省三个主要产地的葛根药材均适用，可以作为葛根药材及其制剂质量检测的依据。

[1] 国家药典委员会.中国药典 [M].一部. 北京：化学工业出版社，2010.

[2] 邹清波.葛根素对心血管系统的药用价值[J].中国现代药物应用,2010，4(12):124-125.

[3] 王文亮，杜方岭，祝清俊.葛根素提纯方法研究新进展[J].中国食物与营养,2009(8):40-42.

[4] 徐轶尔，李秋红，杨菲菲.中药葛根的药理药效研究[J].吉林中医药,2010，30(11):993-994.

[5] CHEN X, CAI F, GUO S, et al. Protective effect of Flos puerariae extract following acute alcohol intoxication in mice[J]. Alcohol Clin Exp Res,2014,38(7):1839-1846.

[6] SOOK KY, SOO LI, SOOK KJ. Protective effects of puerariae radix extract and its single compounds on methylglyoxal-induced apoptosis in human retinal pigment epithelial cells[J]. J Ethnopharmacol,2014,152(3):594-598.

[7] ZHANG Y, YUAN J, WANG Y, et al. LC-MS/MS determination and pharmacokinetics study of puerarin and daidzein in rat plasma after oral administration of Gegenqinlian decoction and Radix Puerariae extract[J]. Pharmacogn Mag,2014,10(39):241-248.

[8] 温切木·吐尔，伊丽米古丽·阿布杜扎伊尔.葛根素临床应用进展[J].临床合理用药杂志,2011，4(12):121-122.

[9] 陈玉，郑萍.川产葛根药材的HPLC指纹图谱[J].华西药学杂志,2008，23(2):217-218.

[10] 王黎，高苏亚，李华.不同产地葛根的HPLC指纹图谱及质量评价研究[J]. 安徽农业科学,2011(18):10782-10784.

[11] 陈添福，杨玉琴，张丽艳，等. 贵州葛根高效液相色谱指纹图谱研究[J]. 中国药业,2008(3):10-11.

[12] 冷红琼，张郴，秦智彬，等.云南产葛根HPLC指纹图谱研究[J].昆明医科大学学报,2012(6):39-42.

[13] 郭艳艳，成春燕，黄静丽，等.不同来源葛根遗传多样性ISSR分析[J].大众科技,2013(4):134-136.

[14] 张雷红，沈小钟，张现涛，等.葛根药材指纹图谱分析方法研究[J].广东微量元素科学,2010(7):29-33.

[15] 沈梦洁，冯昕韡，朱仲良.葛根HPLC指纹图谱及模式识别研究[J].内蒙古大学学报：自然科学版,2012(1):73-76.

[16] 陈树和，陈荔炟，巴赛，等.葛根总黄酮的HPCE指纹图谱研究[J].中国药房,2010(39):3709-3711.

[17] 赵晨曦，袁大林，Christy Chan，等.葛根异黄酮色谱指纹图谱-抗氧化活性关系研究[C].全国计算机化学学术会议论文集，2009.

[18] 方从兵，宛晓春，江昌俊，等.葛根药用成分异黄酮的HPLC指纹图谱分析[J].热带作物学报,2005(2):39-44.

[19] 何春年，李敏，曹志高，等.葛根药材HPLC指纹图谱研究[J].中国中药杂志,2003(12):41-45.

[20] 陈丽.葛根与葛根提取物及葛根注射液指纹图谱研究[J].现代医药卫生,2010(8):1153-1155.

(责任编辑：魏 晓)

Study on Fingerprints of Radix Puerariae and its Extract in Hubei Province

Liu Huimin1,Xu Huifang1,Shao Beibei2
(1.Wuhan hospital of traditional chinese medicine, Department of pharmacy, Wuhan 430010, China；
2.Wuhan united Pharmacy,Wuhan 430011, China)

Objective:To establish the fingerprints of Radix Puerariae and its extract in Hubei Province for the quality control.Methods:The fingerprints of Radix Puerariae and its extract were established by HP LC. The chromatographic separation was perfermed on a TIANHE Kormasil C18column(4.6 mm×150 mm, 5μm). The mobile phase consisted of methanol and 1% acetic acid with gradient elution. The f low-rate was 1.0mL·min-1, the column temperature was at 35℃ and the UV absorbance detection was at 250nm.Results:Under the selected chromate graphic conditions, a good fingerprint of Radix Puerariae and its extract were obtained. The fingerprint of Radix Puerariae from Zhuxi Shiyan, Enshi and Luotian Huanggang were basically identical.Conclusion:The quality of Radix Puerariae and its extract can be controlled effectively by HPLC-UV fingerprint. The Preparation process of the extract from Radix Puerariae is stable and feasible.

Radix Puerariae; Radix Extract； Fingerprint; Quality Control

2015-01-20

刘慧敏(1987-)，女，武汉市中医医院中药师，研究方向为中药新制剂与新技术。

R284

A

1673-2197(2015)11-0025-05

10.11954/ytctyy.201511011