化疗药物顺铂和阿霉素联合应用体外研究

包丽娜，包永睿,2,3，孟宪生,2,3*，王 帅,2,3

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 沈阳 110074；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 116600)



化疗药物顺铂和阿霉素联合应用体外研究

包丽娜1，包永睿1,2,3，孟宪生1,2,3*，王 帅1,2,3

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 沈阳 110074；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 116600)

目的：定量分析抗肿瘤药物顺铂和阿霉素联合应用的协同、相加或拮抗作用，筛选顺铂和阿霉素联合应用的最佳配比。方法：不同配比的化疗药物顺铂和阿霉素处理HepG2细胞24h，MTT法测定HepG2细胞的增殖抑制作用，Cbou-Talalay法计算药物的联合指数和两种药物对HepG2细胞的敏感性，分析药物不同配比的相互作用，筛选顺铂和阿霉素联合应用的最佳配比。结果：顺铂、阿霉素单独和联合应用对HepG2细胞的抑制率呈剂量依赖性量效关系；两种药物以小差别比例配伍时，小剂量联合应用呈现拮抗作用，大剂量联合应用呈协同作用；两种药物以大差别比例配伍时，联合效应结果相反；综合药物联合指数和两种药物对HepG2细胞的敏感性，优选出顺铂和阿霉素联合应用的最佳配比为1∶15。结论：化疗药物顺铂和阿霉素不同配比联合应用均可产生增强互补、减毒增效的作用。

顺铂；阿霉素；中效原理；联合指数；联合药物敏感性

原发性肝癌为我国恶性肿瘤死亡率排名第二的疾病，临床治愈率较低，多采用药物治疗。顺铂作用广泛、抑瘤活性强，是用于治疗恶性肿瘤的首个铂类药物， 阿霉素细胞毒性较大，为目前治疗肝细胞癌最有效药物之一[1]。顺铂和阿霉素联合治疗肝细胞癌为目前最常用的化疗方案[2-5]，但临床应用时给药比例不一致。本实验以肝癌细胞株HepG2为主要对象，在体外利用MTT法观察顺铂和阿霉素单用或联合应用对肝癌细胞HepG2增殖的影响，并利用中效原理筛选顺铂联合阿霉素治疗肝肿瘤的最佳配比。现具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞系HepG2，购于上海细胞库。顺铂为江苏豪森药业股份有限公司生产，批号：130701；阿霉素为Actavis Italy S.p.A公司生产，批号：2QLO051，使用时用培养液配置并稀释[6-8]。

1.2 细胞培养

HepG2细胞使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基(美国GIBCO公司)培养，当细胞生长至80%～90%时，将细胞进行1∶2传代。

1.3 方法

1.3.1 药物效应检测 取处于对数生长期的HepG2细胞，经胰酶消化制成单细胞悬液，接种于无菌的96孔板中，使每孔细胞密度为5×103个，将孔板放于37℃恒温CO2培养箱中培养24h。实验设药物处理组、对照组和空白对照组。联合用药方案为：依据临床化疗方案给药比例及两种药物IC50值设置药物配比，分别为1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30。采用MTT法分别测定顺铂和阿霉素单独给药及联合给药对HepG2细胞生长的影响。

1.3.2 结果判定方法 依据中效原理方程式fa/fu=(D/Dm)m(fa：效应，fu=1-fa，D：剂量，Dm：中效剂量)，计算药物合用对HepG2细胞的敏感性及药物各效应的联合指数CI[4-9]。fa即抑制率，计算公式：抑制率(fa)=(对照组吸光值-实验组吸光值)/对照组吸光值×100%。

m值越大，说明联合药物组的敏感性越高。CI=D1/DX1+D2/DX2+αD1D2/DX1DX2，D1、D2为药物合用产生效应的各自浓度，DX1DX2为药物单用时达到相同效应的浓度；两种药物作用机制相同α=1，两药作用机制不同α=0，顺铂和阿霉素作用机制不同，故α=0。CI<1，药物的相互作用为协同作用；CI=1，药物的相互作用为相加作用；CI>1，药物的相互作用为拮抗作用。

1.4 统计分析

每份样本平行测定3孔，每个药物试验组与阴性对照组比较，采用SPSS17.0统计软件进行方差分析、直线回归和相关分析。

2 结果

2.1 顺铂、阿霉素单独应用对HepG2细胞效应

随药物浓度的梯度增加，药物对HepG2细胞的生长抑制率也随之增加。采用SPSS17.0软件对logD、logfa/fu作直线回归分析，计算两种药物单独应用的中效浓度Dm。结果见表1。

2.2 顺铂和阿霉素联合应用对HepG2细胞效应

根据中效原理方程式fa/fu=(D/Dm)m，采用SPSS17.0软件对logD、logfa/fu作直线回归分析，计算两种药物各配比合用时中效浓度Dm、对HepG2细胞敏感性(m值)及联合指数CI，并绘制指数-效应曲线。结果见表2、图1。

表1 顺铂和阿霉素对HepG2细胞增殖抑制效应

表2 各药物组的直线回归方程相关参数及m值、CI值

根据直线回归方程中斜率m值的大小，可判断出各配比组顺铂与阿霉素联合应用对HepG2细胞的敏感性大小顺序为3>4>5>6>2>1。由图1可知，顺铂和阿霉素配比为1∶1、1∶5时，两种药物联合指数随剂量增大而增大，但1∶5配比两药合用产生协同作用的剂量范围较大；顺铂和阿霉素配比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶30时，两种药物联合指数随剂量增大而减小，且1∶15、1∶20、1∶30组产生协同作用的剂量范围均较大。由于三组协同作用差异较小，综合考虑联合药物敏感性，顺铂和阿霉素联合应用的最佳配比为1∶15，其协同作用、敏感性均最强。

3 讨论

人类肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种常见的恶性肿瘤，预后极差，为我国死亡率第二的恶性肿瘤。目前，临床主要治疗方法为手术切除，对于不能行手术切除的患者，可给予化疗药物治疗[9]。顺铂和阿霉素是治疗肝癌常用的一线化疗药物，临床常联合给药。顺铂是周期非特异性药物，阿霉素属蒽环类化合物，两药合用无论是体内还是体外均可产生协同作用，比药物单独化疗有更好的效果，但临床联合化疗时，药物的配比并不固定[10]。

中效原理即Cbou-Talalay联合指数法，是目前国内外评价药物相互作用公认的方法，主要采用联合指数(CI)评价药物的相互作用，判断药物联合应用的协同或者拮抗作用，可定量反映药物协同效应的剂量范围。联合药物敏感性即联合应用药物对细胞的敏感程度，可反映不同配比药物对癌细胞的敏感性。

本实验根据顺铂、阿霉素的临床用药剂量，并参考两种药物对HepG2细胞抑制率的IC50，选择1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30进行联合应用。当两种药物以小差别比例(1∶1、1∶5)配伍时，小剂量联合应用呈现拮抗作用，大剂量联合应用呈现协同作用；而两药以大差别比例(1∶10、1∶15、1∶20、1∶30)配伍时，联合作用结果相反。实验结果显示，两个指标分别筛选出的最优配比不一致，故本实验在药物相互作用为协同效应的前提下，比较各比例配伍组的联合药物敏感性，优选顺铂和阿霉素联合应用的最佳配比。因而，联合用药时可选择最佳配伍比例达到最高效应时的最小剂量进行，尽可能增加两药的协同作用。

图1 量效曲线

注：CI<1，协同作用；CI=1，相加作用；CI>1，拮抗作用。

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(责任编辑：李岚春)

Studies of Chemotherapy Drugs Cisplatin and Doxorubicin Combined Application in Vitro

Bao Lina1,Bao Yongrui1,2,3,Meng Xiansheng1,2,3*,Wang Shuai1,2,3

(1.College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine;2.Liaoning Province Multi-Component Chinese Medicine Engineering Technology Research Center；3.Liaoning Province Modern TCM Research and Engineering Laboratory,Dalian 116600,China)

Objective:Quantitative evaluation of the relationship between anticancer drugs cisplatin and doxorubicin combined effect of screening the best ratio of combination therapy. Methods:Different ratios of cisplatin and gemcitabine's inhibition rates of HepG2 cells was measured by MTT assay. Utilize median-effect principle to calculate combination index and the sensitivity of the two drugs on HepG2 cells，and evaluate drug interactions.Results:Cisplatin and Adriamycin's inhibition rate of HepG2 cells in a dose-dependent relationship between dose no matter alone and in combination. Small doses of the drug combination, showing a synergistic effect，and high-dose combination is showing antagonism. Integrated drug combination index and the sensitivity of the two drugs on HepG2 cells，the best ratio optimized cisplatin and adriamycin is 1:15.Conclusion:Median-effect principle is often used to evaluate drug interactions in vitro, which evaluation can be combined with the drug, the best ratio of anticancer drugs combined screening applications.

Cisplatin；Doxorubicin；Median-effect principle；Combination index；Combining drug susceptibility

2014-12-04

国家“十二五”“重大新药创制”科技重大专项(2013ZX09507005)；辽宁省教育厅一般项目(L2014361)

包丽娜(1989-)，女，辽宁中医药大学硕士研究生，研究方向为药物分析。E-mail:976145703@qq.com

孟宪生 (1964-)，男，辽宁中医药大学教授，研究方向为中药组分配伍、代谢组学及药品质量分析。E-mail:mxsvvv @126.com

R737.31

A

1673-2197(2015)08-0022-02

10.11954/ytctyy.201508011