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冬虫夏草中主要核苷类成分测定

2015-04-26

亚太传统医药 2015年17期
关键词:腺嘌呤核苷冬虫夏草

朱 秋

(驻马店市第一中医院,河南 驻马店 46300)



冬虫夏草中主要核苷类成分测定

朱 秋

(驻马店市第一中医院,河南 驻马店 46300)

目的:通过使用灵敏、可靠的液相色谱-质谱联合同时进行分离和电喷雾电离质谱的方法(LC/ESI-MS)检测冬虫夏草中胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷和虫草素。开发新的检测冬虫夏草中主要核苷类成分的方法。方法:使用液相色谱-质谱联合同时进行分离和电喷雾电离质谱的方法(LC/ESI-MS),检测冬虫夏草中胸腺嘧啶,腺嘌呤,腺苷和虫草素。结果:该方法成功用于同时检测冬虫夏草中核苷的成分。结论:LC/ESI-MS方法在中药活性成分的分析是一种非常有效的技术。

冬虫夏草;核苷类;LC/ESI-MS

冬虫夏草在我国传统中医学主要用于治疗高血糖症,呼吸疾病和肝脏疾病,及肾功能不全、肾功能衰竭等[1]。核苷是冬虫夏草中非常重要的质量控制指标[2]。目前有几种技术可用于冬虫夏草中主要核苷的分析,如薄层色谱法(TLC)[3]、高效液相色谱(HPLC)[4]和毛细管电泳[5]。然而,这些方法通常可确定只有一个或两个相对含量较高的核苷,而对于一些相对微量的核苷检测并不是特别灵敏,但是这些微量核苷也是冬虫夏草质量重要判定指标。本研究开发了一个简单和可靠的液相色谱(LC)-mass光谱检测器(MS)联合电喷雾离子化(ESI)方法,同时进行分离和测定该类核苷。

1 仪器

质谱仪LCMS-2010,液相色谱系统,VP-ODS(2.0mm×150mm)(岛津,京都,日本),DGU-14A脱气机。C18Guard-pak cartridge(沃特斯,米尔福德,MA,USA)。通过资料和验证,设定[M+H]+ions 的m/z值在127,136,268,252和302。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称取各标样10mg,分别置于10mL量瓶中,用25%甲醇精确定容。精密称取各待测样本0.1g,置于10mL试管中,分别使用回流法、研磨和超声法提取,取5mL上清液,再用25%甲醇定容至刻度。

2.2 色谱条件优化

在使用LC/ESI-MS法时,流动相的选择应考虑分析物分离后并产生电离的影响。对于核苷从虫草和其类似物中的分离,一些报道已经指出使用梯度洗脱的流动相,包括KH2PO4缓冲液和甲醇,但由于低挥发性和高盐浓度,这种溶剂系统不适合于LC/ESI-MS分析。因此,醋酸铵被选择用于控制移动相的酸度。用乙酸铵和甲醇作为流动相和梯度洗脱程序,使得四个主要核苷可成功被分开。

2.3 标准曲线建立

每组七个非零点校准样,1.0~117.5μg/mL为胸腺嘧啶,1.8~127.0μg/mL为腺嘌呤,0.6~114.0μg/mL为腺苷和0.5~107.5μg/mL为虫草素作为计算标准曲线。校准曲线是通过绘制每种分析物的峰面积比(Y)的计算,并在LC/ESI-MS对浓度(X,μg/mL)每个标准物一式三份进行分析,浓度为10μg/mL。

表1 主要核苷类类线性方程

2.4 线性关系考察

通过以上的方程,得知由于胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、虫草素都存在于冬虫夏草提取物,事实上并不存在所谓的真正的空白对照。因此使用溶剂作为空白对照进行了分析,结果证明在m/z为127、136、268、252和302数值下没有检测到任何峰值,因此,在各个样本加入浓度分别为2、20、100μg/mL时,胸腺嘧啶测出值分别为:2.06、19.7、101.6;腺嘌呤测出值分别为:1.96、20.7、99.3;腺苷测出值分别为:1.96、20.3、99.6;虫草素测出值分别为:2.08、20.04、99.3。通过以上结果得知,相关性R在0.998 9~0.999 1之间,说明了不同浓度的分析数据保持了非常良好的线性关系。

2.5 精密度实验

通过6次重复进样测试,计算各个峰值的面积RSD值分别为0.64%、0.51%、0.27%和0.47%,与同类型的文献数据结果基本一致,表明该方法精密度良好。

2.6 稳定性测试

在0、2、4、6、8、12、24h时间点进样测定各组分的含量,结果表明以上各个时间点的样本在数据上无明显差异,表明RSD的值分别为1.04%、2.00%、1.75%和1.42%,验证了有效成分在24h内稳定。

2.7 样品回收率测试

取以上样本,每份约10mg,加入胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、虫草素的标准样本混合溶液5mL,各有效成分的回收率分别如下:胸腺嘧啶为99.40%,腺嘌呤为98.98%,腺苷为99.27%,虫草素为98.20%,结果可靠、稳定。

3 讨论

冬虫夏草由于产量有限,需求量高,因此目前市场上存在大量的假冒伪劣产品,并且常规方法很难辨别,而一般的测定方法,均有其局限性,如常规的HPLC、凝胶电泳法等只能测定其中一到两种主要核苷,而对于相对微量的核苷则不敏感[1-3]。由于常规的冬虫夏草定量分析需要0.3~0.6g样本,单株的冬虫夏草一般很难达到要求,而本研究中,冬虫夏草的用量可以控制在0.1g以内,大大减少了材料的需求,同时也能够达到单株间比较的目的。考虑到核苷是水溶性的,因此在提取时不能使用常规的方法进行提取,本实验选择甲醇作为溶剂,同时,甲醇浓度的梯度实验验证了25%的浓度得率最高。

另外,在样本的初步提取方面,比较了三种不同的方法,包括细胞研磨、回流提取和超声破碎,由于虫草与其他孢子类菌不同,子坐和虫体都比较难研磨,因此选择回流提取。通过使用梯度洗脱系统和2-氯腺苷为内参,找到了适合的LC/ESI-MS的方法来检测冬虫夏草中的四个主要核苷,方法包括分离和测定,并且通过了最终的验证。目前在虫草的成分分析上,HPLC和凝胶电泳是比较常规的检测方法,但是单纯使用一种分析方法往往只能检测到其中的几种核苷成分,本研究通过仪器上的联用和方法学上的改进,新的模型可用于快速准确地鉴定虫草材料中核苷的含量差异,尤其是通过仪器的联用,达到了对多个不同属性以及较难检测核苷的检测。而在常规方法的检测中,常常会遇到检测不到鸟嘌呤、胸腺嘧啶和虫草素等情况。使用LC/ESI-MS联用的手段解决了以上的难题,由于可以检测多种不同的核苷,这也帮助我们发现了来源、产地、储存时间和条件等不同,样本中的核苷含量也有所不同,为以后进一步的研究奠定了基础。因此,本研究结果表明,使用LC/ESI-MS方法在中药活性成分的分析中是一种非常有效的技术。

[1] 梁洪卉,程舟,杨晓伶,等. HPLC定量分析冬虫夏草的主要核苷类有效成分[J].中药材,2008,31(1):25.

[2] 李绍平,李萍.季晖,等.毛细管电泳法测定冬虫夏草中核苷类的含量[J].药物分析杂志,2001,21(2):71.

[3] 陈作红,田向荣,孟祥贤,等.古尼虫草核苷类成分的高效液相色谱分析[J].菌物系统,2003,22(3):489-493.

[4] 丁婷,胡丰林,耿德贵,等.冬虫夏草及其无性型菌株发酵液中核苷类成分的HPLC法定量分析[J].食品与发酵工业,2006,32(6):97-99.

[5] 钱正明,周妙霞,孙敏甜,等.冬虫夏草不同部位核苷类成分比较分析[J].世界科学技术—中医药现代化,2014(11):58.

(责任编辑:魏 晓)

2015-04-30

朱秋(1972-),男,河南省驻马店市第一中医院主管中药师,研究方向为中药鉴别及制剂深加工。

R284

A

1673-2197(2015)17-0028-02

10.11954/ytctyy.201517014

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