响应面法优化龙胆苦苷的纯化工艺

向志芸，李小芳，罗开沛，罗 佳，林 浩，严敏嘉

(成都中医药大学 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137)



响应面法优化龙胆苦苷的纯化工艺

向志芸，李小芳*，罗开沛，罗 佳，林 浩，严敏嘉

(成都中医药大学 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137)

目的：应用响应面法优选龙胆苦苷的大孔树脂纯化工艺。方法：通过预实验和单因素试验，根据星点设计-响应面法设计原理，采用三因素五水平响应面分析方法，以龙胆苦苷的转移率和龙胆苦苷的百分含量为考察指标，对上柱液浓度、洗脱剂浓度、洗脱剂用量进行优化，最终确定龙胆苦苷的大孔树脂纯化工艺。结果：采用HPD-100型大孔树脂，最佳纯化工艺为：上柱液质量浓度为0.2g/mL,乙醇浓度为30%，乙醇用量为5BV，龙胆苦苷的百分含量可达到73.4%。结论：星点设计-响应面法优化龙胆中龙胆苦苷的纯化工艺效率高、方法简便、预测性好，可用于实验室小量制备，为扩大再生产提供参考。

龙胆；龙胆苦苷；星点设计-效应面法；大孔树脂；纯化工艺

龙胆(Gentianachinensis)为龙胆科植物条叶龙胆(GentianamanshuricaKitag)、龙胆(Gentian.ascabraBge.)、三花龙胆(GentianatrifloraPall. )或滇龙胆(GentianarigescensFranch.)的干燥根和根茎,前三种习称“龙胆”，后一种习称“坚龙胆”，具有清热、泻肝、定惊之功效。据《现代本草纲目》[1]记载，因其叶如龙葵，味苦如胆，因此而得名。化学成分研究表明，龙胆苦苷(gentiopicroside，GTP)是龙胆科植物龙胆、秦艽等活性最强的有效成分之一[2]。现代药理研究表明，龙胆苦苷对多种肝损伤具有显著的保护作用，还具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎镇痛作用，具有非常重要的开发价值[3]。龙胆苦苷已获得SFDA新药证书。为更好地开发利用它，本实验进行了龙胆苦苷的最佳纯化工艺研究，以期使龙胆苦苷得到进一步开发和有效利用。

1 仪器与试药

UV-6100型紫外可见分光光度计，PS-60A型超声波清洗器，BP-61 电子天平，Q-250B3型高速多功能粉碎机,龙胆饮片购于四川新荷花中药饮片股份有限公司(批号:1111044，产地:云南)，粉碎至粗粉，备用。龙胆苦苷对照品购于成都曼思特生物科技有限公司(批号:MUST-14081205)，D101、D301、AB-8、HPD-100、HPD300型大孔树脂( 沧州宝恩吸附材料科技有限公司) ，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 龙胆上柱液的制备

准确称取龙胆药材10g,60%乙醇加热回流提取3次，第1次2h，第2次1h，第3次1h,溶剂用量为12倍。合并3次提取液，减压回收溶剂，浓缩后离心，加入适量水，制得一定浓度的龙胆上柱液。

2.2 龙胆苦苷含量测定方法

2.2.1 最大吸收波长的确定 分别取不同浓度的对照品溶液和样品溶液在200～800nm作紫外扫描，确定最大吸收波长为274nm。

2.2.2 对照品溶液配制及标准曲线绘制 精密称取0.003 28g溶液置25mL棕色容量瓶中，先用10mL 70%乙醇溶解，再加乙醇定容于至刻度，摇匀，即得。精密吸取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL于容量瓶中，得龙胆苦苷浓度为6.56g/mL、13.12g/mL、19.6g/mL、26.24g/mL、32.8g/mL、39.36g/mL的溶液，以70%乙醇稀释至刻度，用紫外分光光度计在274nm处，以70%乙醇为随行空白，测定吸光度，所得结果以龙胆苦苷溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标作线性回归，得回归方程为A=0.019 2C+0.011 4，(r=0.999 1)，对照品浓度在13.12～39.36μg/mL范围内线性关系良好。实验所需进行含量分析的样品，均采用以上回归方程进行线性回归计算，得含量测定结果。

2.3 龙胆苦苷纯化工艺优选

2.3.1 单因素实验 ①静态-吸附解析试验筛选树脂型号。准确称取5种经预处理的干树脂(D101、D301、AB-8、HPD-100、HPD300)各4g于100mL具塞磨口锥形瓶中，分别加入20mL的龙胆上柱液(按龙胆药材计为0.10g·mL-1)，放置24h并适当振摇，滤过，取上清液测定龙胆苦苷的质量浓度，计算树脂的吸附量和吸附率。将已吸附饱和的不同树脂置于100mL具塞磨口锥形瓶中，分别加20mL 30%乙醇振荡24h进行静态洗脱，测定洗脱液中龙胆苦苷的质量浓度，计算洗脱率。以树脂吸附量、吸附率和洗脱率为评价指标，筛选出最佳树脂。结果显示，HPD-100型树脂对龙胆苦苷的吸附-洗脱性能最佳。②上柱液浓度对树脂吸附效果的影响。分别取10mL药材质量浓度为0.05g/mL,0.1g/mL,0.2g/mL,0.3g/mL,0.5g/mL的龙胆上柱液，上于15mL HPD-100大孔树脂柱，以2BV/h的流速通过大孔树脂，分别测定流出液中GTP的质量浓度，并计算GTP的吸附量和吸附率。结果显示，选择上样药材质量浓度为0.3g/mL较适宜。③HPD-100型树脂对龙胆苦苷动态吸附性能的考察。将药材质量浓度为0.3g/mL的上柱液加于装有15mLHPD-100型树脂的树脂柱上，控制流速为2BV/h，每4mL收集一份流出液，测定各流出液中龙胆苦苷的质量浓度，绘制动态吸附泄露曲线，横坐标为流出液体积(mL),纵坐标为龙胆苦苷的吸附量(mg/mL)。结果显示：15mL树脂泄露前流出液的体积为4mL。此时树脂床共吸附GTP 92mg，湿态HPD100树脂对GTP的工作吸附量(泄漏前吸附量)可达6.13mg/mL。④上柱流速对吸附的影响。取10mL药材质量浓度为0.3g/mL的龙胆上柱液4份，分别加于装有15mL HPD-100型树脂的树脂柱上，上柱液分别以1BV/h、1.5BV/h、2BV/h、3BV/h的流速通过HPD-100树脂柱，收集流出液，测定流出液中GTP浓度，计算吸附率。结果显示：当流速为3BV/h时，吸附率达到最高(96.3%)。⑤洗脱剂的确定。取10mL药材质量浓度为0.3g/mL龙胆上柱液5份，分别加于装有15mL HPD-100型树脂的树脂柱上，控制上柱流速和洗脱流速均为3BV/h,待吸附完全后，用3BV的去离子水洗去树脂表面或内部残留的多糖、无机盐等水溶性杂质，分别用4BV的10%、20%、30%、40%、50%的乙醇液进行洗脱，测定各流出液中GTP的含量，计算洗脱率。结果显示20%乙醇的洗脱率可达到80%，随乙醇浓度增加，洗脱率在增大，当乙醇浓度达到40%时，洗脱率达到最大(85%)，故洗脱剂浓度在20%～40%均可。⑥洗脱剂用量考察。取10mL药材质量浓度为0.3g/mL的龙胆上柱液上于HPD-100型树脂柱，控制上柱流速为3BV/h,待吸附完全后，用3BV去离子水洗涤树脂，用30%乙醇洗脱液洗脱，控制洗脱流速为3BV/h，每1BV收集一份流出液，测定流出液中龙胆苦苷的质量浓度。结果显示：当洗脱液体积达到5BV时，能基本洗脱完全，所以，初步确定洗脱液用量为5BV。⑦洗脱流速的确定。取10mL药材质量浓度为0.3g/mL的龙胆上柱液上于HPD-100型树脂柱，流速为3BV/h，待吸附完全后，用3BV的蒸馏水洗脱，再用5BV 30%乙醇分别以1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h的流速进行洗脱，测定30%乙醇洗脱液中GTP的质量浓度，计算GTP的洗脱率。结果显示：当洗脱流速3BV/h时，洗脱率最高。

2.3.2 星点设计-效应面试验与结果 在以上单因素试验基础上，根据星点设计-响应面法试验设计原理选择对龙胆苦苷纯化影响较大的三个因素即上柱液浓度、乙醇浓度、洗脱剂用量为考察因素，龙胆苦苷的转移率(y1)和干膏中龙胆苦苷的百分含量(y2)为评价指标，采用三因素五水平分析方法设计实验，因素水平见表1，试验设计及结果见表2。数据处理采用“归一化法”，运用Hassan[4]方法分别对各指标进行数学转换求“归一值”(dmax)，计算公式为dmax=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)，然后计算“总评归一值(OD)”，计算公式为OD=(d1·d2···dn)1/n(n为指标数)。

表1 因素水平

表2 星点设计试验与结果

2.3.3 模型建立与回归分析 以OD值为因变量，使用Design-expert8.0.5b软件对各因素进行多元线性回归和二项式拟合，得多元线性回归方程Y=-1.398 27+2.145a+0.018 6b+0.203 9c(r=0.604)，二项式拟合方程为Y=-12.065 7+10.309 8a+0.464 9b+1.632 0c-0.009 9ab+0.821 3ac-0.008 6bc-34.211 1a2-0.006 7b2-0.131 5c2(r=0.989)，线性回归方程相关系数小，二项式拟合方程相关系数大，说明二项式拟合方程拟合效果好，可信度高，可用于对龙胆苦苷的纯化工艺进行分析和预测。

2.3.4 工艺优化和预测 根据回归方程，作相应曲面图和等高线图(图1～图3)，求导结果显示，当上柱液质量浓度0.2g/mL，乙醇浓度为30.27%，乙醇用量为5.71BV时，OD值最大，龙胆苦苷的百分含量达到73.3%。考虑到实际生产情况，确定优化工艺为：上柱液质量浓度0.2g/mL，乙醇浓度为30%，乙醇用量为5BV。

2.3.5 验证试验 按优化后的最佳纯化工艺进行3次平行试验，结果表明，3次验证试验纯化产物中龙胆苦苷的百分含量的实测值为73.2%、72.9%、72.4%，与预测值偏差分别为1.20%、0.87%、1.03%，说明模型预测性良好，二项式模型具有较高的可靠性。

3 讨论

龙胆苦苷具有显著的抗肝损伤、抗病毒、抗炎作用，具有重要的开发价值。本实验采用星点设计-响应面法优化龙胆苦苷的大孔树脂纯化工艺，使干膏粉末中龙胆苦苷的百分含量最高达到73.2%，达到了提高有效成分相对含量的目的，可为减少以龙胆为主要成分的制剂的服用量提供参考，可为实验室小量制备龙胆苦苷或工业大生产提供参考。

图1 上样液的浓度(a)和洗脱剂的浓度(b)的相互作用对龙胆苦苷纯化工艺影响的效应面和等高线

图2 上样液的浓度(a)和洗脱剂用量(c)的相互作用对龙胆苦苷纯化工艺影响的效应面和等高线

图3 洗脱剂的浓度(b)和洗脱剂用量(c)的相互作用对龙胆苦苷纯化工艺影响的效应面和等高线

[1] 黄泰康.现代本草纲目[M]. 北京：中囯医药科技出版社,2001.

[2] 杨书彬，王承. 龙胆化学成分和药理作用研究进展[J].中医药学报，2006，33(6):54-56.

[3] 刘占文，陈长勋，金若敏，等. 龙胆苦苷的保肝作用研究[J].中草药，2002，33(1):47-50.

[4] 吴伟，陆彬. 实验设计中多指标的优化: 星点设计和总评“归一值”的应用[J].中国药学杂志,2000,35(8):530-533.

(责任编辑：宋勇刚)

Purification Process for Gentiopicroside by Response Surface Method

Xiang Zhiyun，Li Xiaofang*，Luo Kaipei，Luo Jia，Yang Lu，Lin Hao,Yan Minjia

(Chengdu University of TCM；Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese herbal medicines；System of traditional Chinese medicine resources and Development Utilization of Ministry of State Key Laboratory Breeding Base，Chengdu 611137，China)

Objective:The response surface method preferred gentiopicroside macroporous resin purification process.Methods:Pre-test and single factor test，according to the design-response surface methodology design principles，using three factors and five levels of response surface analysis methods to transfer rate and the percentage of gentiopicroside gentiopicroside for inspection indicators of concentration on the column，eluent concentration，eluent usage optimization，and ultimately determine gentiopicroside macroporous resin purification process.Results:HPD-100 macroporous resin，optimum purification process: the concentration of the liquid column 0.2g/mL，the ethanol concentration of 30%，the amount of ethanol 5BV，gentiopicroside percentages reach 73.4%.Conclusion:design-response surface methodology to optimize high gentian gentiopicroside purification process efficiency，easy way to predict，and can be used to prepare a small laboratory and provide reference for the expanded reproduction.

Gentian;Gentiopicroside;Design-response Surface Methodology;Macroporous Resin;Purification Process

2015-04-14

四川省教育厅重点项目(15ZA0094)

向志芸(1990-)，女，成都中医药大学硕士研究生，研究方向为中药新剂型及中药新技术。E-mail：498939565@qq.com

李小芳(1964-)，女，成都中医药大学教授，博士生导师，研究方向为中药新剂型及中药新技术。E-mail：lixiaofang918@163.com

R284

A

1673-2197(2015)17-0016-04

10.11954/ytctyy.201517009