通过检测非结构蛋白抗体评价口蹄疫疫苗纯度的研究

赵丽霞，关平原，陈君彦，李超华，高 瑛，牛秀岭，张立华，赵丹彤，郝雪斌，李 敏，高日明，武春芳

（1.金宇保灵生物药品有限公司，呼和浩特010030；2.内蒙古农业大学，呼和浩特010018）

通过检测非结构蛋白抗体评价口蹄疫疫苗纯度的研究

赵丽霞1，关平原2，陈君彦1，李超华1，高 瑛1，牛秀岭1，张立华1，赵丹彤1，郝雪斌1，李 敏1，高日明1，武春芳1

（1.金宇保灵生物药品有限公司，呼和浩特010030；2.内蒙古农业大学，呼和浩特010018）

为探索通过检测非结构蛋白（NSPs）抗体的方法评价口蹄疫疫苗纯度的可行性，用不同纯化工艺制备口蹄疫O型、亚洲1型、A型三价灭活疫苗，重复免疫牛至少3次后，定期检测NSPs的ELISA抗体并统计分析抗体情况。结果显示，高度纯化疫苗组的NSPs抗体阴性率远高于普通纯化疫苗组，表明通过检测NSPs抗体评价口蹄疫疫苗纯度可以作为质量控制的一种方法。

口蹄疫疫苗；非结构蛋白；抗体；纯度

口蹄疫（Foot and Mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的在偶蹄动物间传播的烈性传染病［1］。大多数亚洲、非洲、南美洲国家一直都通过注射灭活疫苗的办法来控制该病的流行［2］。因此，生产高质量FMD疫苗是防控口蹄疫的关键要素之一。尽管国内疫苗的生产工艺已有提高，但FMD疫苗仍会存在含有痕迹量非结构蛋白（Nonstructural proteins，NSPs）的风险。NSPs（如3A、3B、2B、2C、3ABC）相对保守［4］，参与病毒复制、多聚蛋白裂解和病毒颗粒的组装过程［3］。FMD疫苗免疫特别是多次重复免疫之后，痕迹量的NSPs可能刺激机体产生抗体。OIE建议，通过检测接种至少三次口蹄疫疫苗的动物血清，以是否产生非结构蛋白抗体，来评价疫苗的纯度［5］。

目前，国内口蹄疫灭活疫苗抗原纯化浓缩工艺水平有待进一步完善和优化。一些严格控制FMD疫苗质量的生产厂家通过改进生产工艺，大大降低了疫苗的总蛋白含量。但国内对于疫苗纯化程度、蛋白含量及NSPs产生的详细报道还很少，因此本研究参照OIE推荐的方法，进行了NSPs抗体检测的实验研究。

1 材料与方法

1.1 制苗用毒株和试剂 口蹄疫O／Mya98／BY／2010株、Asia1／JSL／06株和Re－A／WH／09株抗原，均由金宇保灵生物药品有限公司提供。ISA206复合型油佐剂，购自法国SEPPIC公司。牛、羊口蹄疫病毒抗体检测试剂盒（FMD－3ABC Bo－Ov），购自美国爱德士生物科技公司。

1.2 实验动物 犊牛（O型、亚洲1型、A型液相阻断ELISA抗体滴度≤1∶8，NSPs抗体为阴性），来源于定点供应基地。成年牛，来源于动物免疫背景清晰的养殖场。

1.3 实验疫苗的配制 将高度纯化灭活抗原O／Mya98／BY／2010株、Asia1／JSL／06株、Re－A／WH／09株抗原，普通纯化灭活抗原O／Mya98／BY／2010株、Asia1／JSL／06株、Re－A／WH／09株抗原，分别按重量比1∶1，与206佐剂充分乳化制备成口蹄疫O型、亚洲1型、A型三价灭活疫苗，将其分别编为高度纯化组C001、高度纯化组C002、普通纯化组P001和普通纯化组P002，2～8℃备用，剂量1 mL／头份。

1.4 146S、蛋白和内毒素含量的检测 将上述4批疫苗（C001、C002、P001、P002）进行146S、总蛋白含量和内毒素含量的检测。

1.5 实验疫苗免疫后NSPs抗体的检测 选取上述4批口蹄疫O型、亚洲1型、A型三价灭活疫苗免疫犊牛，按疫苗分 4组（C001、C002、P001、P002），每组8头牛，双倍头剂免疫2 mL／头，重复免疫接种疫苗3次，免疫间隔时间30 d［5］。同时设5头牛做空白对照组。在首免14 d、28 d，二免14 d、28 d，三免14 d、28 d、56 d，采血分离血清，定期利用牛、羊口蹄疫病毒抗体检测试剂盒（FMD－3ABC Bo－Ov）跟踪检测其NSPs抗体。

1.6 免疫养殖场NSPs抗体的检测 选择免疫历史背景清楚的养殖场，选同龄牛300头随机分为3组（E组、Y组、N组，每组100头），E组免疫高度纯化疫苗，Y组免疫普通纯化疫苗，N组免疫普通纯化疫苗和高度纯化疫苗。分别采集血清，利用牛、羊口蹄疫病毒抗体检测试剂盒（FMD－3ABC Bo－Ov）检测其NSPs抗体，对比分析NSPs抗体情况。

2 结果

2.1 实验疫苗146S含量、总蛋白含量和内毒素含量检测结果 实验疫苗进行146S含量、总蛋白含量和内毒素含量的检测，结果详见表1。高度纯化疫苗组的146S含量高于普通纯化疫苗组，而其总蛋白含量低于普通纯化疫苗组。两组实验疫苗的内毒素均小于0.45 EU／mL。

表1 实验疫苗146S含量、总蛋白含量和内毒素含量检测结果

2.2 实验疫苗免疫后NSPs抗体检测结果 将4批实验疫苗重复免疫实验犊牛3次，定期采血检测结果见表2。高度纯化组C001和C002牛三免后56 d一直没有出现NSPs抗体阳性；但普通纯化组P001在二免14 d就出现NSPs抗体阳性，普通纯化组P002则在一免28 d就出现NSPs抗体阳性。

2.3 免疫养殖场NSPs抗体的检测结果 经高度纯化疫苗和普通纯化疫苗免疫的E、N、Y组NSPs抗体检测结果见表3。免疫高度纯化疫苗E组的NSPs抗体阴性率为98%；免疫普通纯化疫苗和高度纯化疫苗N组的NSPs抗体阴性率为61%；免疫普通纯化疫苗Y组的NSPs抗体阴性率仅为32%。

表2 实验疫苗免疫后NSPs抗体检测结果

表3 养殖场三个免疫组NSPs抗体的检测结果

3 讨论

由实验疫苗免疫犊牛后NSPs抗体检测结果可知，高度纯化疫苗组重复免疫3次牛后，直到三免后56d仍未出现NSPs抗体阳性，说明疫苗纯化效果比较好；普通纯化疫苗组经过重复免疫3次牛后，在不同时间段出现NSPs抗体阳性，究其原因可能与普通纯化疫苗多次重复免疫之后，会产生痕迹量的NSPs蛋白有关［5］。

由三个免疫养殖场NSPs抗体的检测结果可知，高度纯化抗原制备的疫苗免疫动物后NSPs抗体阴性率远高于普通纯化疫苗组。由此表明，NSPs抗体的阴性率与疫苗抗原的纯化程度相关。

目前，通过用凯氏定氮法或lowrry法检测口蹄疫疫苗总蛋白含量，为控制疫苗蛋白含量起到了一定的指导作用，但对于评估疫苗非结构蛋白产生的情况，不具有完全等效性，所以为达到质量预防的目的应开发一种能够实时监控疫苗生产过程中非结构蛋白的评估方法。据某试剂盒厂家介绍，利用口蹄疫病毒非结构蛋白液相阻断ELISA检测试剂盒，能够定量检测病毒培养液中的NSPs，从而实时监控生产过程中去除NSPs成分的效果，可以应用于疫苗质量控制，但此方法目前国内尚待应用测试。

口蹄疫疫苗的质量评价，除安全性、效力（PD50）、146S含量、总蛋白含量、内毒素含量等检测指标外，NSPs抗体的检测也可以为评价口蹄疫疫苗纯度提供一定的指导意义。众所周知，感染口蹄疫病毒动物的NSPs抗体为阳性［5］，免疫非纯化疫苗也会产生NSPs抗体阳性，这种情况会对区分感染与免疫造成干扰，同时影响免疫效果。通过本实验可以证明高度纯化口蹄疫疫苗免疫动物后NSPs抗体为阴性，因此，提高疫苗纯化效果和相应的NSPs抗体检测方法结合使用，可以为将来区分感染与免疫群组提供数据支持，为口蹄疫防控及净化起到积极作用。

［1］江鹏斐，谢庆阁.应用口蹄疫病毒非结构蛋白区分感染动物和注苗动物［J］.中国兽医科技，1999，29（12）：47－48.

［2］唐海波，童晓辉.欧盟口蹄疫政策发生重大改变［J］.中国兽医学报，2003，23（6）：572.

［3］毕研丽，沈小燕，才学鹏，等.用口蹄疫病毒非结构蛋白区分注苗动物和自然感染动物研究进展［J］.生物技术通讯，2008，19（3）：448.

［4］De Diego M，Brocchi E，Mackay D，et al.The non－structural polyprotein 3ABC of foot－and－mouth disease virus as a diagnostic antigen in ELISA to differentiate infected from vaccinated cattle［J］.Arch Virol，1997，142（10）：2021－2033.

［5］OIE.Foot and mouth disease［M］／／OIE Terrestrial Manual.2012：20－21.

（编 辑：李文平）

Study on the Foot－and－Mouth Disease Vaccine Purity by Testing for Antibodies against Nonstructural Proteins

ZHAO Li－xia1，GUAN Ping－yuan2，CHEN Jun－yan1，LI Chao－hua1，GAO Ying1，NIU Xiu－ling1，ZHANG Li－hua1，ZHAO Dan－tong1，HAO Xue－bin1，LI Min1，GAO Ri－ming1，WU Chun－fang1
（1.Jinyu Baoling Biopharmaceutital Ltd.Company，Hohhot010030，China；2.Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot010018，China）

To examine the feasibility of evaluating the purity of the foot－and－mouth disease vaccine by testing the nonstructural proteins ELISA antibodies，the type O，type Asia 1，type A inactivated foot－and－mouth disease vaccines that were purified and processed differently immunized the cattle repeatedly at least three times.Hereafter，the nonstructural proteins ELISA antibodies were monitored regularly，statistics and analysis on the results of the NSPs ELISA antibodies were collected.It has shown that the negative rate of the nonstructural proteins ELISA antibodies of the highly purified vaccine group is significantly higher than that of averagely purified vaccine group.It is suggested that estimating the purity of the foot－and－mouth disease vaccine by means of the NSPs ELISA antibodies detected can be a method to control the qualities.

foot－and－mouth disease vaccine；nonstructural proteins；antibody；purity

2015－02－17

A

1002－1280（2015）04－0017－04

S858.2

赵丽霞，兽医师，从事兽用生物制品质量保障工作。E－mail：zhaolixia＠jinyubaoling.com.cn