不同产地、不同品种间绞股蓝总皂苷和总多糖含量比较研究

彭 亮，李诒光,2*，陈 杰，饶 毅，季巧遇，魏惠珍

(1.江西中医药大学，江西 南昌 330006；2.江中药业股份有限公司，江西 南昌 330096)



不同产地、不同品种间绞股蓝总皂苷和总多糖含量比较研究

彭 亮1，李诒光1,2*，陈 杰1，饶 毅1，季巧遇1，魏惠珍1

(1.江西中医药大学，江西 南昌 330006；2.江中药业股份有限公司，江西 南昌 330096)

目的：建立绞股蓝中总皂苷、总多糖含量测定方法，比较不同产地、不同品种绞股蓝中总皂苷、总多糖含量差异，为考察药材内在质量提供依据。方法：采用紫外-可见分光光度法，以人参皂苷Re为对照品，于550nm波长处对绞股蓝总皂苷吸光度进行测定；以D-无水葡萄糖为对照品，于490nm波长处对绞股蓝总多糖吸光度进行测定。结果：人参皂苷Re在0.097 8～0.489mg 范围内与其吸光度呈良好的线性关系(R2=0.999 8)，平均回收率为97.79%，RSD为1.44%(n=6)；D-无水葡萄糖在0.0198～0.099mg 范围内与其吸光度呈良好的线性关系(R2=0.999 4)，平均回收率为99.58%，RSD为1.35% (n=6)。结论：该方法简便可行、重复性好，适用于绞股蓝中总皂苷、总多糖含量测定。不同产地绞股蓝中总皂苷和总多糖含量差异较大，且不同品种间绞股蓝总皂苷含量存在显著性差异，但绞股蓝总多糖含量与绞股蓝品种无相关性。该结果可为绞股蓝的质量控制和相关产品的开发研究提供参考依据。

绞股蓝；总皂苷；总多糖；提取；含量测定

绞股蓝为葫芦科绞股蓝属多年生草本植物Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.的根茎或全草[1-3]，又名七叶胆、天堂草、公罗锅底、遍地生根等。该属植物基源复杂、品种繁多，全世界约有16个种属和3个变种，我国有14个种属和3个变种[4]，广泛分布于陕西、湖北、安徽、福建、云南、广西等地。其味苦微甘，性凉，归肺、脾、肾经，具有清热解毒、化痰止咳、益气健脾、养阴生津、养心安神等功效[5]。现代药理学研究表明，绞股蓝含有大量皂苷、多糖和黄酮类成分，此外还含有少量氨基酸、维生素和微量元素等，其中皂苷和多糖是其主要成分[6-7]。临床研究发现绞股蓝具有抗癌、抗氧化、降血脂、免疫调节、镇静止痛及抗溃疡等作用，可用于高血压、高血脂、高血糖、脂肪肝等疾病的治疗。

绞股蓝作为一种与人参相似的免疫增强剂，有“南方人参”的美誉，民间称其为神奇的“不老长寿药草”，且作为五加科以外唯一含有与人参皂苷相似结构有效成分的植物，在保健食品和新型药品研发上都有巨大的应用前景，是一种新型药食两用植物资源[8-11]。目前，绞股蓝还未被收载入药典，其道地药材的选择也未确定，各产地的绞股蓝质量差别较大，影响了绞股蓝药材及其产品的疗效，制约了绞股蓝药材资源的开发利用。目前，关于不同产地、不同品种间绞股蓝总皂苷、总多糖含量比较的研究尚未见文献报道。为进一步评价绞股蓝药材的质量，本研究采用HPLC法测定绞股蓝中总皂苷、总多糖含量，并比较不同产地、不同品种间总皂苷、总多糖的含量差异，以期为绞股蓝药材的质量控制及资源开发利用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-1800紫外可见分光光度计(日本岛津)；SK5200LH超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；AB204-N型精密分析天平(Mettler Toledo上海衡器有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)。

1.2 试药

绞股蓝药材经鉴定为葫芦科绞股蓝属多年生草本植物Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的根茎或全草，药材来源见表1。人参皂苷Re对照品(批号为110754-201324，中国食品药品检定研究院)，D-无水葡萄糖对照品(批号为110833-200904，中国食品药品检定研究院)。水为纯净水，石油醚、冰醋酸、高氯酸、乙醇、正丁醇、硫酸等其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总皂苷含量测定

2.1.1 对照品溶液制备 取干燥至恒重的人参皂苷Re对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成浓度为0.489mg·mL-1的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取绞股蓝药材干燥粉末(过四号筛)约1.5g，精密称定，置于索氏提取器中，加石油醚(60～90℃) 适量，加热回流至提取液无色，弃去石油醚液，药渣连同滤纸挥干溶剂，药渣移入具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇溶液60mL，回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并滤液，蒸干，残渣加适量热水充分溶解，离心10min(3 500r/min)，取上清液，水层溶液用水饱和的正丁醇溶液萃取(4次×20mL)，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

表1 绞股蓝药材样品来源

2.1.4 最大吸收波长确定 将显色后的对照品和供试品溶液于200～700nm 波长范围内进行扫描，结果显示对照品和供试品溶液在550nm附近均有最大吸收。

2.1.5 标准曲线制定 精密吸取人参皂苷Re对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置于10mL具塞试管中，60℃挥干溶剂，分别精密加入 5% 香草醛冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8mL，混匀，密塞，置于60℃水浴中15min，取出后立即用流水冷却，加冰醋酸5mL，混匀，以空白试剂为对照，于550nm波长处测定吸收度。以吸光度(A)为纵坐标Y，以对照品取样量(mg)为横坐标X，进行线性回归，求得回归方程为：Y=4.017 4X-0.039 9，R2=0.999 8(n=5)。结果表明，人参皂苷Re在0.097 8～0.489mg范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.6 精密度试验 精密吸取同一份人参皂苷Re对照品溶液，按照“2.1.5”项下方法操作，在同一条件下连续测定5次吸光度，分别为0.361、0.363、0.359、0.358、0.360，RSD为0.53%，表明精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 取绞股蓝药材样品 (陕西平利-1)，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.5”项下方法制作标准曲线，分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h后测定吸光度，依次为0.461、0.454、0.467、0.457、0.452、0.463，RSD为1.24%，表明绞股蓝药材样品溶液在2.5h内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验 取同一批绞股蓝药材样品(陕西平利-1)5份，每份1.5g，按照“2.1.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1.5”项下方法在同一波长下分别测定吸光度，并代入回归方程计算样品中总皂苷含量，分别为4.13%、4.09%、4.16%、4.18%、4.06%，平均含量为4.12%，RSD为1.18%，表明该方法重复性良好。

2.1.9 加样回收试验 取已知含量的绞股蓝药材样品 (陕西平利-1) 6份，每份0.75g，精密称定，每份分别精密加入一定量的人参皂苷Re对照品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.5”项下方法测定吸光度，计算回收率 (以人参皂苷Re计)。结果表明人参皂苷Re平均回收率为97.79%，RSD为1.44%，表明该方法回收率良好，见表2。

表2 人参皂苷Re回收率测定结果

2.1.10 样品中总皂苷含量测定 分别取各产地药材1.5g，精密称定，平行2份，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.5”项下方法制作标准曲线，在同一条件下分别测定吸光度，计算各产地绞股蓝总皂苷含量，结果见表3。

表3 绞股蓝药材中总皂苷含量测定结果 (n=2)

2.2 总多糖含量测定

2.2.1 对照品溶液制备 取干燥至恒重的D-无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水溶解制成浓度为0.099mg·mL-1的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取绞股蓝药材干燥粉末(过四号筛)约1.0g，精密称定，置于索氏提取器中，加95%乙醇适量，加热回流至提取液无色，过滤，挥干乙醇，药渣移入具塞锥形瓶中，精密加入50mL 蒸馏水，回流提取2次，每次1.0h，过滤，合并滤液，加适量95%乙醇沉淀多糖使醇沉浓度达到75%，4℃下静置12h，离心15min(3 500r/min)，沉淀加水溶解并转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 最大吸收波长确定 将显色后的对照品和供试品溶液于200～700nm 波长范围内扫描，结果表明对照品和供试品在490nm附近均有最大吸收。

2.2.5 标准曲线制定 精密吸取D-无水葡萄糖对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置于10mL具塞试管中，加水定容至2.0mL，再分别加入5%苯酚溶液1.0mL，摇匀，迅速加入硫酸5.0mL，摇匀，放置10min，置于40℃水浴中加热15min，取出迅速冷却至室温。以空白溶剂校正零点，于490nm波长处测定其吸光度。以吸光度( A) 为纵坐标Y，对照品量(mg) 为横坐标X 进行线性回归，求得回归方程为：Y=7.171 7X+0.0164，R2=0.999 4(n=5)。结果表明，总多糖在0.0198～0.099mg范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度试验 精密吸取同一份D-无水葡萄糖对照品溶液，按照“2.2.5”项下方法制作标准曲线，在同一条件下连续测定5次吸光度，分别为0.295、0.291、0.302、0.297、0.294，RSD为1.38%，表明该方法精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取绞股蓝药材样品 (陕西平利-1)，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.5”项下方法制备标准曲线，于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h测定吸光度，分别为0.391、0.378、0.381、0.386、0.395、0.379，RSD为1.79%，表明绞股蓝样品溶液在2.5h内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验 取同一批绞股蓝药材样品 (陕西平利-1) 5份，每份1.0g，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.5”项下方法制备标准曲线，在同一条件下分别测定吸光度，并代入回归方程计算样品中总多糖含量分别为1.96%、1.92%、1.99%、1.89%、1.92%，平均含量为1.94%，RSD为1.91%，表明该方法重复性良好。

2.2.9 加样回收试验 取已知含量的绞股蓝药材样品 (陕西平利-1) 6份，每份0.5g，精密称定，每份分别精密加入一定量的D-无水葡萄糖对照品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.5”项下方法制备标准曲线，在同一条件下分别测定吸光度，计算回收率。结果表明D-无水葡萄糖平均回收率为99.58%，RSD为1.35%，表明该方法回收率良好，见表4。

2.2.10 样品中总多糖含量测定 分别取各产地药材1.0g，精密称定，平行2份，按照“2.2.2”项下制备供试品溶液，按照“2.2.5”项下方法制定标准曲线，在同一条件下分别测定吸光度，计算各产地绞股蓝总多糖含量，结果见表3。

2.3 不同产地间绞股蓝总皂苷和总多糖含量比较

将收集到的绞股蓝样品以品种为分类依据，分别对5个产地七叶绞股蓝样本和5个产地五叶绞股蓝样本中的总皂苷和总多糖含量进行统计分析。结果表明，七叶绞股蓝5个产地样本 (陕西平利-1、湖北十堰、湖北神农架、广西桂林、福建古田) 中总皂苷和总多糖含量差异显著，具有统计学意义(P<0.01)，见表5；五叶绞股蓝5个产地样本 (陕西平利-2、陕西平利-3、陕西平利-4、云南昆明、安徽亳州) 中总皂苷和总多糖含量差异显著，具有统计学意义(P<0.01)，见表6。

表4 D-无水葡萄糖回收率测定结果

表5 5个产地七叶绞股蓝样品总皂苷、总多糖含量比较 (±s，n=10)

表6 5个产地五叶绞股蓝样品总皂苷、总多糖含量比较 (±s，n=10)

将收集到的绞股蓝样品以品种为依据分为七叶绞股蓝组和五叶绞股蓝组，进行比较分析。结果表明，七叶绞股蓝组所含总皂苷含量明显高于五叶绞股蓝组，且差异具有统计学意义(P<0.01)，见表7；五叶绞股蓝组所含总多糖含量稍高于七叶绞股蓝组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表8。

表7 七叶绞股蓝和五叶绞股蓝总皂苷平均含量比较 (±s，n=10)

表8 七叶绞股蓝和五叶绞股蓝总多糖平均含量比较 (±s，n=10)

3 讨论

10个不同产地的绞股蓝总皂苷含量在0.34%～7.99%之间，10个不同产地绞股蓝总多糖含量在1.56%～3.82% 之间，且不同产地绞股蓝总皂苷和总多糖含量差异较大，可能是由于绞股蓝生长受到温度、湿度、土质、光照等生长环境因素影响所致。

七叶绞股蓝总皂苷平均含量(6.11%)明显高于五叶绞股蓝(0.58%)，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示绞股蓝皂苷含量与品种存在相关性；五叶绞股蓝总多糖平均含量(2.62%)稍高于七叶绞股蓝(2.35%)，但差异无统计学意义(P>0.05)，提示绞股蓝多糖含量与品种无相关性。

在总皂苷含量测定实验中，考虑到绞股蓝药材中脂溶性成分对紫外测定干扰较大，故先用石油醚进行脱脂处理，除去部分脂溶性成分，减少其在紫外测定中的干扰。

在总多糖含量测定实验中，考虑到绞股蓝中含有大量皂苷成分，故在提取过程中先用95%乙醇回流处理，不仅能除去大部分皂苷，还能除去一部分单糖、寡糖等小分子物质，有利于多糖的提取、纯化。

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(责任编辑：尹晨茹)

Study on the Total Saponins and Polysaccharides Content inGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino from Different Producing Areas and Different Varieties

Peng Liang1,Li Yiguang1,2*,Chen Jie1,Rao Yi1,Ji Qiaoyu1,Wei Huizhen1

(1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006,China; 2.Jiangzhong Pharmaceutical Corporation, Nanchang 330096,China)

Objective:Take the content of total saponins and polysaccharides as index, to establish a method for assaying the saponins and polysaccharides, to compare the diversity of total saponins and polysaccharides content inGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino from different producing areas and different varieties, to provide basis for the study of its internal quality.Methods:The UV spectrophotometry was used to determine the contents of total saponins and polysaccharides. The detection wavelength are 550nm and 490nm respectively. The reference substance are Ginsenosides Re and D-Glucose.Results:Good linear relationship with absorbability occurred when Ginsenosides Re in the range of 0.097 8～0.498mg (R2=0.999 8), and the average recovery was 97.79% (RSD=1.44%, n=6). Good linear relationship with absorbability occurred when D-Glucose in the range of 0.019 8～0.099mg (R2=0.999 4), and the average recovery was 99.58% (RSD=1.35%, n=6).Conclusion:The established method is simple, accurate and can be used for the determination of total saponins and polysaccharides. The total saponins content exist differences inGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino from different producing areas and different varieties. The total polysaccharides content exist differences in Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino from different producing areas, but the content of total polysaccharides have no correlation with varieties. The results can able to provide reference for quality control of Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino and related product development research.

Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino;Total Saponins;Total Polysaccharides;Extraction;Content Determination

2015-05-07

彭亮(1990-)，男，江西中医药大学硕士研究生，研究方向为中药质量控制。

李诒光(1974-)，男，博士，江中药业股份有限公司主任中药师，研究方向为中药质量评价与开发。E-mail:lyg@jzjt.com

R284.1

A

1673-2197(2015)22-0021-04

10.11954/ytctyy.201522009