高效降解展青霉素乳酸菌的分离鉴定及去除机理研究

龚 雪，田丰伟，翟齐啸，王 刚，张秋香，张 灏，陈 卫，2，*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122）

高效降解展青霉素乳酸菌的分离鉴定及去除机理研究

龚 雪1，田丰伟1，翟齐啸1，王 刚1，张秋香1，张 灏1，陈 卫1，2，*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122）

目的：从发酵食品材料中筛选出对展青霉素（PAT）有去除作用的乳酸菌。方法：将从传统发酵蔬菜中分离得到的乳酸菌与展青霉素共培养，利用高效液相色谱法（HPLC）测定共培养体系中PAT毒素的减少量，筛选出一株高效去除PAT毒素的乳酸菌菌株。通过微生物形态学、16S rDNA测序鉴定，确定该菌的系统分类学地位。通过比较不同致死方式对实验菌株去除展青霉素效能的影响，并研究细胞壁和胞内物质对PAT的去除效果，初步探索乳酸菌去除展青霉素的机理。最后研究不同因素处理对实验菌株去除PAT毒素的影响。结果：从发酵食品材料中筛选出一株高效去除PAT的菌株LB-11，经初步鉴定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。致死菌和细胞壁的去除效率显著低于有活性的完整菌体，推测乳酸菌去除展青霉素主要机理为生物降解作用。在温度为20～30℃和pH为3～7的条件下实验菌株对PAT均有较高的去除效率。结论：LB-11对PAT具有较高的去除效率，在合适的条件下，在24 h内对PAT的去除率达到了98.34%，是一株极具应用价值的益生菌。

乳酸菌，展青霉素（PAT），菌种鉴定，去除率

展青霉素（Patulin，简写为PAT）又称棒曲霉素，是青霉属、曲霉属、丝衣霉属等多种真菌的次生代谢产物[1]。动物展青霉素中毒急性症状包括肌肉震颤、对外界刺激敏感、肌肉痉挛、胃肠溃疡等症状[2]。慢性毒性表现为神经毒性、免疫毒性及基因毒性[3]。它主要存在于苹果和苹果制品以及梨、葡萄、甜椒和胡萝卜等水果和蔬菜中[4]，给人类带来食品安全风险。国际上建议人类食用的苹果产品中的棒曲霉素残留量应小于50 μg/kg[5]。固体苹果产品中最大限量为25 μg/kg，儿童用苹果汁和婴儿食品中最大限量为10 μg/kg[6]。

目前，控制展青霉素的方法主要有物理方法和化学方法。物理方法如原料清洗、树脂吸附等容易使展青霉素进入清洗用水或富集到吸附材料中，对环境构成潜在的威胁；化学方法如臭氧降解、添加化学添加剂等由于成本昂贵或者安全性尚不明确，多停留在实验阶段，还未见实际应用[7]。生物法由于成本低，操作简单，安全性高而成为近年来的研究热点。对展青霉素有较好去除作用的微生物主要为酵母菌[8]，而目前国内外对乳酸菌的研究较少，且去除效率较低。乳酸菌作为益生菌能在动物体内定殖发挥其多种有益于健康的功效，探索乳酸菌在去除食品或饲料中展青霉素的应用具有重大的实用价值。

本研究将从传统发酵食品中筛选获得能够高效去除展青霉素的乳酸菌菌株，并对其进行菌种鉴定。同时考察不同温度、pH、展青霉素浓度等对实验菌株去除展青霉素效果的影响。最后比较不同致死方式对实验菌株去除展青霉素效能的影响，并用超声波破碎细胞，分离出细胞壁和胞内物质，研究其对PAT的去除效果，初步探索乳酸菌去除展青霉素的机理。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本实验所用到的12株菌株 分离自自然发酵蔬菜中；蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、大豆蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、硫酸镁、硫酸锰、吐温-80、氯化钠、磷酸二氢钾 由中国医药集团上海化学试剂公司提供；甲醇（色谱纯和）乙腈（色谱纯） 购自江苏汉邦科技有限公司；展青霉素标准品（PAT） 购自北京泰乐琪科技有限公司。

Waters 1525高效液相色谱仪（HPLC） Waters公司；5424R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；VCX150PB超声波破碎仪 美国索尼克斯公司；SX-300高压蒸汽灭菌锅 日本TOMY公司；ZHJHC1109C超净工作台 上海智诚分析仪器制造有限公司；GRP-9160恒温培养箱 一恒科技有限公司；Centrifuge 5415R冷冻离心机、Centrifuge 5804R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Milli-Q Reference超纯水系统 德国Millipore公司；ZHWY-100H恒温摇床 上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.2 主要试剂的配制

1.2.1 MRS培养基 参照《微生物学实验技术》课本的配方并略作调整[9]，主要配方如下：蛋白胨10 g，牛肉浸膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，柠檬酸氢二铵2 g，磷酸氢二钾2 g，七水合硫酸镁0.58 g，四水合硫酸锰0.19 g，吐温-80 1 mL；将上述内容物以1000 mL蒸馏水溶解后，用1 mol/L盐酸或1 mol/L氢氧化钠调节溶液pH至6.2～6.4，115℃湿热灭菌20 min；MRS固体培养基是在MRS液体培养基配方的基础上，添加1.5%～2.0%的琼脂，115℃湿热灭菌20 min。

1.2.2 展青霉素

1.2.2.1 PAT贮备液 准确称取5 mg的展青霉素标准溶液，溶于50 mL乙酸乙酯中，充分混匀溶解，并使用0.22 μm微孔滤膜进行过滤除菌后贮存于-20℃，得到浓度为100 mg/L的展青霉素贮备液[10]。

1.2.2.2 PAT工作液 根据需要，准确量取一定体积的展青霉素标准品母液，用氮气吹干后溶于pH4.0水中，并定容至100 mL，配制成不同浓度的展青霉素工作液。

1.3 实验方法

1.3.1 去除PAT菌株的筛选 参照张茜等[11]的方法筛选食品样品中的乳酸菌并略作调整，具体方法为：取1 mL拍打均匀发酵蔬菜匀浆加入到30 mL MRS培养基中富集培养，37℃培养20 h。梯度稀释涂布于添加0.02%溴甲酚紫的MRS平板上。挑取变色圈明显的单菌落，反复划线得到纯化的单菌落，挑选菌落直径在1～3 mm之间，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，乳白、灰白或暗黄色等符合乳酸菌菌落特征的菌株，进行革兰氏染色，挑选革兰氏阳性、无芽孢菌株。

以2%接种量将菌株传代两次后，离心10 min（5000 r/min，4℃）收集菌体，再用磷酸盐缓冲液（pH7.2）洗涤离心2次。将获得的菌体重悬于1 mL含PAT浓度为1000 μg/L的生理盐水中（pH4.0），调整菌浓度在1010CFU/mL左右，置于转速为150 r/min的摇床中37℃培养24 h后取样，离心10 min（12 000 r/min，4℃），取上清液使用0.22 μm微孔滤膜进行过滤后用高效液相色谱仪检测PAT残存浓度，同时设未加入菌体的同浓度PAT溶液作为阴性对照。检测条件：色谱柱Unitary C18，150 mm×4.6 mm×5 μm；流动相为乙腈∶水=10∶90，流速1 mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长276 nm，上样量为20 μL，展青霉素的出峰时间为8.1～10.1 min[12]。

1.3.2 菌株鉴定 将菌种接种于10 mL MRS液体培养基中，37℃静置培养20 h，收集菌体，采用上海生工生物工程技术服务有限公司DNA抽提试剂盒提取基因组DNA。以提取出的基因组DNA为模板，使用上海生工生物工程技术服务有限公司的细菌16S rDNA通用引物（27F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）和1492R：5′AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3′）进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖电泳检测后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序并利用MEGA 6.0软件构建系统发育树。

1.3.3 菌体活性对实验菌株去除PAT的影响 现有的研究报道提出乳酸菌能够通过物理吸附包括黄曲霉毒素、重金属离子在内的多种毒素[13-14]。本研究通过比较活菌与致死处理后菌株对PAT去除率的差异，初步确定实验菌株对PAT的作用类型。分别采用热致死（121℃，20 min）、酸致死（2 mol/L，1 h）、甲醛致死（37℃，2 h）处理使菌失活，研究菌体活性对实验菌株去除展青霉素的影响[14]。

1.3.4 菌株去除PAT机制初探 为了进一步确定实验菌株是通过非特异性与展青霉素结合还是分泌某种酶来降解展青霉素，设计了以下实验：收集实验菌株菌体，悬浮于磷酸盐缓冲液（pH7.2），调整其浓度为1010CFU/mL，超声波破碎（400 W，工作时间5 s停顿时间5 s）30 min[15]，破碎后离心（14000×g，4℃）10 min，取上清液得到菌株胞内物质，沉淀为菌株细胞壁。分别取1010CFU完整活细胞菌体，菌株细胞壁和胞内物质和一定浓度展青霉素溶液共培养，于25℃转速为150 r/min的摇床中培养24 h后离心取上清，使用HPLC检测展青霉素残留浓度，同时设未加入菌体的同浓度PAT溶液作为空白对照。

1.3.5 温度、PAT浓度、pH等对实验菌株去除PAT的影响 将菌种按2%接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养，待菌株生长到对数中后期时，离心收集菌体，再用磷酸盐缓冲液（pH7.2）洗涤离心2次。

研究温度对实验菌株去除PAT的影响，分别在温度为15、20、25、30、37、45℃下，使1010CFU菌体与1 mL浓度为1000 μg/mL的PAT在转速为150 r/min摇床中共培养24 h后离心10 min（12000 r/min，4℃）取上清，用HPLC检测上清中PAT残存浓度。每个样品做三个平行，同时设未加入菌体的同浓度PAT溶液作为阴性对照。

选择最优培养温度，PAT浓度对实验菌株去除展青霉素的影响选用500、1000、1500、2000 μg/L四种毒素浓度；pH的影响选用pH分别为2、3、4、5、6和7共6个pH梯度；研究菌体浓度对去除效果的影响时，选用浓度分别为1×1010、5×109、2.5×109CFU/mL的菌体，研究其在不同时间间隔（0.5、4、8、12、24 h）对展青霉素的去除情况。研究以上因素对PAT去除率的影响时，均选择最佳去除温度，另外除了这些因素变量外，其他条件均与研究温度对PAT去除率的影响时的条件一致。

1.3.6 去除率的计算

PAT去除率（%）=（阴性对照PAT浓度-菌液样品上清PAT浓度）/阴性对照PAT浓度×100

1.3.7 数据处理和统计分析 本文的数据采用Excel软件进行处理，使用SPASS 20.0软件进行统计学处理，以One-way ANOVA两两比较中的Tukey法进行显著性分析，以p＜0.05时为差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选结果

采用添加0.02%溴甲酚紫的MRS平板稀释分离泡菜中的乳酸菌，根据MRS平板颜色变化及菌落形态对乳酸菌进行初步筛选，将初选到的菌落进行革兰氏染色，取革兰氏阳性、无芽孢符合乳酸菌特性的菌落进行展青霉素去除实验，一共分理出12株类似乳酸菌菌株分别标号为LB-1～LB-12将这12株菌进行PAT去除实验，结果如表1所示。从表1中可以看出，菌株LB-11显示出最高的展青霉素去除能力，PAT初始浓度为1000 μg/L时，菌体和PAT毒素在37℃转速为150 r/min的摇床中共培养24 h后，该菌株对展青霉素的去除率达到了90.78%，显著高于Shaimaa等[16]的研究结果。Shaimaa等[16]研究了5株不同的乳酸菌株对展青霉素的去除作用，发现的两株乳酸菌对展青霉素具有一定的去除能力，但使用1010CFU的乳酸菌对浓度为1000 μg/L的PAT在24 h内的最高去除率仅为52.9%，明显低于本研究中的LB-11。

表1 12株菌株的PAT去除能力Table 1 PAT removal capacity of twelve strains

2.2 实验菌株的初步鉴定

2.2.1 实验菌株形态特征观察 实验菌株LB-11菌落形态：37℃培养48 h，在MRS固体培养基上生长良好，如图1（A）所示，菌落直径约2 mm，菌落表面光滑、有光泽，圆形，边缘整齐，中央略微隆起，呈乳白色。

实验菌株LB-11个体形态：如图1（B）所示，细胞形态为杆状，革兰氏阳性，无鞭毛和芽孢。

图1 菌株LB-11菌落形态和细胞形态Fig.1 The colonial morphology and cell individual characteristic of LB-11

2.2.2 16S rDNA序列测定 将菌株LB-11 16S rRNA基因经PCR扩增并测序后得到长度为1448 bp的基因序列，上传序列至GenBank得到菌株登录号为KM389621，与GenBank内已知基因序列进行同源比对分析，建立系统发育树，确定其发育关系，结果如图2所示。从图2中可以看出该实验菌株与Lactobacillus plantarum 1-3的可信度达100%，可确定该实验菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

2.3 菌体活性对实验菌株去除PAT的影响

如图3所示，当对实验菌株分别采用不同的致死方式致死后，死细胞对展青霉素也具有一定的去除作用，但去除效果显著低于活菌。这表明菌株活性是影响展青霉素去除率的一个重要因素，初步推断实验菌株对展青霉素的去除作用与菌体的代谢活性有很大的相关性。而致死菌株对展青霉素也有一定的去除能力，可能与菌株细胞表面的吸附作用相关。Haskard等[17]研究发现失活的乳酸菌能够有效地去除黄曲霉毒素，主要是由于菌株细胞壁对黄曲霉毒素的物理吸附作用。由此可判断菌株对展青霉素的去除是物理吸附和生物降解的双重作用，而物理吸附对菌株去除展青霉素的影响有限，生物降解起主导作用。由于外界温度、pH等均会通过影响细胞的代谢活性来影响去除效果，因此对外界环境的控制对乳酸菌去除展青霉素尤为重要。

图2 菌株LB-11 16S rDNA序列的系统发育树Fig.2 The phylogenetic tree of LB-11

图3 菌体活性对植物乳杆菌去除PAT的影响Fig.3 Influence of bacterial activity on removal of PAT

2.4 实验菌株去除PAT机制初探

由图4可知，无论是细胞壁还是细胞超声破碎后的上清对展青霉素的去除效率都远低于完整植物乳杆菌细胞的去除率，这进一步排除了细胞壁对展青霉素的表面吸附作用也并非单一是由细胞内的酶起到去除展青霉素的作用，而是依赖于具有活性的完整细胞。细胞通过代谢产生的酶类产物对展青霉素的去除起到了主要作用。

2.5 实验菌株去除PAT的影响因素研究

2.5.1 温度对展青霉素去除效果的影响 由图5可知，实验菌株LB-11去除展青霉素的最适温度范围为20～30℃，其中在25℃时的去除效率最高，实验菌株与1000 μg/L的PAT在25℃共培养24 h后，去除率达到98.34%。超出这个范围去除率随着温度的升高或降低呈现出下降的趋势。推测温度主要是影响菌株代谢酶活性来影响菌株的去除效率，在20～30℃时，去除展青霉素的相关酶系代谢活性较高，因而在这个温度范围内菌株对展青霉素具有较好的去除效果。

图4 植物乳杆菌胞内提取物与细胞壁对PAT去除结果的HPLC图谱Fig.4 The HPLC picture of Pat removal ability of both cell wall and Intracellular extract

2.5.2 PAT初始浓度对去除率的影响 由图6可知，随着PAT初始浓度的增加，实验菌株对展青霉素的去除效果不断降低，但去除率都达到了90%以上。

2.5.3 pH对实验菌株去除PAT的影响 环境pH对微生物的生命活动有很大的影响，从而影响酶的活性。由图7可知，实验菌株在一定的pH范围内都能维持较高的展青霉素去除率，但当pH较低时，细胞代谢活性受到影响[10]，对展青霉素的去除效果显著降低。当pH为2时，实验菌株对展青霉素的去除率仅为22.49%。

图5 温度对植物乳杆菌去除PAT的影响Fig.5 Influence of temperature on removal of PAT

图6 PAT初始浓度对植物乳杆菌去除PAT的影响Fig.6 Influence of initial toxin concentrations on removal of PAT

图7 pH对植物乳杆菌去除PAT的影响Fig.7 Influence of pH on removal of PAT

图8 菌体浓度对植物乳杆菌去除PAT的影响Fig.8 Influence of bacterial concentration on removal of PAT

2.5.4 菌体浓度对实验菌株去除PAT的影响 如图8所示，菌体浓度对实验菌株去除展青霉素的效果也有影响，菌体浓度增加，可以增加菌株代谢酶的浓度，进而提高展青霉素去除率。当菌体浓度为1010CFU/mL时，对展青霉素的去除率随着时间迅速上升，在4 h时实验菌株对展青霉素的去除率已达到84.67%，8 h后可达90%以上，12 h后对展青霉素的去除效果没有明显的变化，24 h时的去除率为98.34%。当菌体浓度为2.5×109CFU/mL时，与1000 μg/L的展青霉素共培养24 h后，去除率仅达到52.75%。

3 结论

通过PAT去除菌的筛选，从泡菜中分离筛选出一株能高效去除展青霉素的菌株LB-11，经鉴定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。通过比较不同致死方式对实验菌株去除展青霉素效能的影响，并用超声波破碎细胞，分离出细胞壁和胞内物质，研究其对PAT的去除效果。结果发现致死菌株对PAT的去除效果显著降低，并且细胞壁对PAT的去除效果也较差，推测该植物乳杆菌对展青霉素的去除作用主要是由生物降解引起的。在pH为4浓度为1000 μg/L的展青霉素溶液中加入浓度为1010CFU/mL的该植物乳杆菌在温度为25℃，转速为150 r/min的摇床中共培养24 h，可将展青霉素的浓度由1000 μg/L降至16.6 μg/L，去除效率达98.34%。说明该菌株有较强的展青霉素去除能力。同时该菌株对展青霉素去除适应的温度和pH范围较广，在20～30℃和pH为3～7的条件下对展青霉素均有较高的去除效率，可广泛应用到食品与饲料中，具有很高的应用价值。

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Isolation and identification of lactic acid bacteria with efficient patulin degradation ability and its degrading characteristics

GONG Xue1，TIAN Feng-wei1，ZHAI Qi-xiao1，WANG Gang1，ZHANG Qiu-xiang1，ZHANG Hao1，CHEN Wei1，2，*
（1.Academy of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Objective：To screen and identify a lactic acid bacteria（LAB）strain with patulin（PAT）detoxification ability from fermented food.Methods：LAB strains isolated from fermented vegetables were co-cultured with PAT.Then the HPLC method was executed to determine the PAT residue after co-culture and one LAB strain with high PAT-degrading ability was selected for further study.The PAT removal efficiency of viable cells and dead cells，as well as different cell components including cell pellets，cell walls and cell extracts were compared，and the factors that impact the capability of PAT degradation of this strain were studied.Moreover，the strain’s taxonomy was confirmed based on morphology characteristics and 16S rDNA gene sequence analysis.Results：A LAB strain with high PAT-removing ability was screened out and identified as a Lactobacillus plantarum.The PAT removal efficiency of dead cells and cell wall were much lower than cell pellets，indicating that the removal mechanism may be attributed to biodegradation.This L.plantarum strain had high PAT-removing ability at temperature of 20～30℃and pH of 3～7.Conclusion：The L.plantarum strain LB-11 had a high removal ability of PAT.The removal efficiency of PAT could reach 98.34%under appropriate conditions within 24 h.This strain could be regarded as a probiotic with potential application on PAT removal.

lactic acid bacteria；patulin（PAT）；identification；removal rate

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0179-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.029

2015－03－04

龚雪（1990-），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail：quchenyuan1@163.com。

*通讯作者：陈卫（1966-），男，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：chenwei66@jiangnan.edu.cn。

国家科技支撑计划（2013BAD18B01）；国家自然科学基金（31371721）。