酶改性大豆分离蛋白起泡性能的研究

计晓曼，马传国，王化林

（河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450001）

酶改性大豆分离蛋白起泡性能的研究

计晓曼，马传国*，王化林

（河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450001）

使用碱性蛋白酶对大豆分离蛋白进行改性，以改善蛋白质的起泡性能。探讨酶水解过程中的酶解时间、酶解温度、底物浓度、加酶量、pH对蛋白起泡能力和泡沫稳定性的影响，在此基础上通过正交实验确定了碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白提高起泡能力的最优水解条件：时间40 min、温度50℃、底物浓度8%、加酶量0.04%、pH8，提高泡沫稳定性最佳水解条件：时间30 min、温度40℃、底物浓度6%、加酶量0.04%、pH9。测定上述条件下大豆分离蛋白的起泡能力和泡沫稳定性分别为217.50%和93.10%。改性前后蛋白质起泡能力和泡沫稳定性均有所改善，与未改性蛋白相比起泡能力和泡沫稳定性分别提高了61.11%和20.38%。

碱性蛋白酶，大豆分离蛋白，起泡能力，泡沫稳定性

大豆蛋白质是人们常用的植物性蛋白，具有人体所需的8种必须氨基酸，同时能降低人体胆固醇含量[1]，是为数不多的可取代动物性蛋白的大宗植物性蛋白[2]。近年来，大豆加工技术和水平不断提高，良好的营养价值和功能性促进了大豆蛋白的消费[3]。大豆蛋白质分子中含有两亲基团，蛋白质分散液在受到搅打时，大量气体混入，蛋白质分子能在水相中吸附至气-液界面，降低表面张力，形成气泡，使大豆蛋白具有起泡性能[4]。大豆蛋白的起泡性能包括起泡能力（foaming capacity）和泡沫稳定性（foaming stability）。大豆蛋白质的起泡性在食品的各个领域得到应用，但仍存在一些缺陷不能满足工业化生产[5]。

改善蛋白质起泡性能的方法有很多，最常用的是物理改性（加热、高压等）、化学改性（磷酸化、酯化等）和酶改性[6]。酶改性因其污染少、效率高得到广泛应用[7]。酶改性是利用蛋白酶的水解作用将蛋白质分子内切或外切成较小分子，增加蛋白质分子内或分子间的交联或特殊基团的功能，从而改变蛋白质的功能性质[8]。酶改性过程中蛋白质被水解，能有效提高蛋白质吸附至液面的能力[9]。

目前很多有关蛋白质改性研究，但多数研究综合考虑蛋白质起泡能力和泡沫稳定性，而对某些特定产品往往需要最佳的起泡能力或泡沫稳定性，同时起泡能力和泡沫稳定性之间通常是相反的，两者受不同分子性质影响[10]，同时考虑需要两者的折中，不能最优化。本实验对蛋白质的起泡能力和泡沫稳定性分别进行研究，通过碱性蛋白酶对蛋白质进行改性，分析改善蛋白质起泡性的最优方案，以期为食品工业利用高起泡性或高泡沫稳定性改性蛋白质提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆分离蛋白 谷神生物科技集团有限公司，蛋白含量89.8%；碱性蛋白酶 200000 U/g，西亚试剂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 分析纯。

FA-25高剪切分散乳化机 上海弗鲁克有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质酶解反应 称取蛋白质配成一定浓度，加入缓冲盐调节一定pH，在80℃下预热10 min，加入一定蛋白酶在一定温度下反应一定时间，反应结束沸水浴灭活10 min，冷却至室温。

1.2.2 起泡性能测定 采用搅打后溶液泡沫体积衡量大豆蛋白的起泡性能。具体测定方法如下：将酶解液定容至1%（w/v），4000 r/min离心20 min。取酶解上清液20 mL于100 mL小烧杯中，搅打2 min，立即移入100 mL量筒中，分别记录搅打停止时液面高度V1和30 min后液面高度V2。未水解蛋白质直接制成1%溶液，测定方法同上[11]。

起泡能力（Foaming Capacity，FC）和泡沫稳定性（Foaming Stability，FS）按如下公式计算：

1.2.3 酶解单因素考察 取不同酶解时间、酶解温度、底物浓度、加酶量、pH为考察因素，以起泡能力、泡沫稳定性为指标进行单因素实验。

酶解时间：选择时间为20、30、40、50、60、70 min，在温度60℃、底物浓度6%、加酶量0.16%、pH8条件下进行酶解。

酶解温度：选择温度为30、35、40、45、50、55、60、65℃，在时间30 min、底物浓度6%、加酶量0.16%、pH8条件下进行酶解。

酶解底物浓度：选择底物浓度为2%、4%、6%、8%、10%，在时间30 min、温度45℃、加酶量0.16%、pH8条件下进行酶解。

酶添加量：选择酶添加量为0%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%（w/v），在时间30min、温度45℃、底物浓度6%、pH8条件下进行酶解。

酶解pH：选择pH6、7、8、9、10，在时间30 min、温度45℃、底物浓度6%、加酶量0.08%条件下进行酶解。

在单因素基础上考察不同因素对起泡能力和泡沫稳定性的影响，分别选取相对应的影响趋势较明显的四个因素进行正交实验。

1.2.4 酶解条件优化

1.2.4.1 起泡能力的优化 根据单因素实验变化趋势，发现pH对起泡能力影响趋势最弱，以起泡能力为指标，固定pH8，对酶解时间（A）、酶解温度（B）、底物浓度（C）、酶添加量（D）进行L9（34）正交实验（表1）。

1.2.4.2 泡沫稳定性的优化 根据单因素实验得到底物浓度对泡沫稳定性影响趋势最弱，选择底物浓度为6%，对酶解时间（A）、酶解温度（B）、酶添加量（C）、pH（D）进行正交实验，对泡沫稳定性进行优化（表2）。

表1 起泡能力正交实验因素水平设计Table 1 The factors and levels of foaming capacity orthogonal experimental design

表2 泡沫稳定性正交实验因素水平设计Table 2 The factors and levels of foaming stability orthogonal experimental design

2 结果与讨论

2.1 未酶解蛋白质起泡性能测定

对原料蛋白质溶液的起泡能力和泡沫稳定性进行测定，分别为135.00%、77.34%。

2.2 酶解时间对起泡性能的影响

图1 酶解时间对起泡性能的影响Fig.1 Effect of time on foaming property

由图1可知，随着酶解时间增加，蛋白质的起泡性能有所改变。起泡能力在20～40 min内变化较明显，之后趋于平缓，在30 min时达到最大，说明在30 min时蛋白质水解产生的小分子肽能迅速在界面展开。泡沫稳定性在前30～50 min内变化明显，在40 min达到最大，说明在此区域水解产生的蛋白肽分子量最为适宜[12]。

2.3 酶解温度对起泡性能的影响

由图2可知，蛋白质的起泡能力和泡沫稳定性均在45℃左右达到最大。这可能由于温度过高时不利于酶的水解，而一定程度的水解使蛋白质内部疏水基团暴露，增加其吸附至界面的能力。同时45℃酶解液产生的泡沫时，粘度较其他酶解液大，这对泡沫稳定性有利[13]。

2.4 底物浓度对起泡性能的影响

由图3可知，随着底物浓度的增加，蛋白质的起泡能力变化较明显，而泡沫稳定性在6%以后趋于平缓。这可能与蛋白质与酶结合存在最佳比例有关，一定范围内增加底物浓度能促进酶解，当两者充分结合后，底物浓度继续增加反而不利于水解。一定浓度蛋白质能增加界面张力，同时分子间形成胶束防止聚集沉淀，增加起泡性能[11]。

图2 酶解温度对起泡性能的影响Fig.2 Effect of temperature on foaming property

图3 底物浓度对起泡性能的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on foaming property

2.5 加酶量对起泡性能的影响

图4 加酶量对起泡性能的影响Fig.4 Effect of enzyme dosage on foaming property

由图4可知，蛋白质的起泡能力随加酶量增加先增加后平缓，泡沫稳定性先增加后降低。随着加酶量增加，更有利于生成促进起泡性能的小分子量产物，但加酶量超过一定限度会造成过度水解。可见加酶量在0.08%时，产生的分子量大小最适宜。

2.6 pH对起泡性能的影响

由图5可知，随着pH增加蛋白质的起泡能力变化不大，而泡沫稳定性在pH7～9之间增加显著。这主要与酶的最适pH有关，pH变化影响分子构象和酶、底物的解离状态，一方面影响两者的相互作用，一方面改变蛋白质分子的柔性，从而对蛋白质的起泡性能造成影响。还可能是在pH9环境下水解产物更不易聚集沉降，从而增大了泡沫稳定性[14]。

图5 pH对起泡性能的影响Fig.5 Effect of pH on foaming property

2.7 正交实验

2.7.1 起泡能力的优化 结果见表3。根据R值可知，对蛋白质起泡能力影响大小排序为B温度＞C底物浓度=D加酶量＞A时间。由k值可得最优组合为A2B3C3D1或者A3B3C3D1，因A2A3的起泡能力相差甚小，且从经济角度出发，最终确定为A2B3C3D1，即时间40 min，温度50℃，底物浓度8%，加酶量0.04%，验证实验表明大豆分离蛋白的起泡能力可达217.50%。

表3 起泡能力正交实验结果Table 3 The results of foaming capacity orthogonal experiment

2.7.2 泡沫稳定性的优化 由表4可知，对蛋白质起泡能力影响大小排序为B温度＞A时间＞D pH＞C加酶量，最优组合为：A1B1C1D3，即时间30 min，温度40℃，加酶量0.04%，pH9，测定此条件下大豆分离蛋白的泡沫稳定性为93.1%。

3 结论

本文使用碱性蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解，单因素实验显示通过水解其起泡能力和泡沫稳定性均得到改善。在单因素基础上，选取对起泡能力、泡沫稳定性影响明显的四个因素进行正交实验，得到起泡能力在时间40 min、温度50℃、底物浓度8%、加酶量0.04%、pH8条件下达到最优，而泡沫稳定性在时间30 min、温度40℃、底物浓度6%、加酶量0.04%、pH9条件下达到最优。改性前大豆蛋白的起泡能力为135.00%，泡沫稳定性为77.34%；改性后大豆蛋白的起泡能力为217.50%，泡沫稳定性为93.10%。

表4 泡沫稳定性正交实验结果Table 4 The results of foaming stability orthogonal experiment

[1]Consonni A，Lovati M R，Manzoni C，et al.Cloning，yeast expression，purification and biological activity of a truncated form of the soybean 7S globulin α′subunit involved in Hep G2 cellcholesterolhomeostasis[J].The Journalofnutritional biochemistry，2010，21（9）：887-891.

[2]De Mejia E G，Martinez-Villaluenga C，Roman M，et al.Fatty acid synthase and in vitro adipogenic response of human adipocytes inhibited by α and α′subunits of soybean βconglycinin hydrolysates[J].Food chemistry，2010，119（4）：1571-1577.

[3]江连洲，胡少新，李杨，等.大豆加工领域的科学技术问题[J].中国食品学报，2012，11（9）：98-110.

[4]Patino J M R，Conde J M，Linares H M，et al.Interfacial and foaming properties of enzyme-induced hydrolysis of sunflower protein isolate[J].Food Hydrocolloids，2007，21（5）：782-793.

[5]SUNG H Y I，CHEN H J E R，LIU T I N Y I N，et al. Improvement of the functionalities of soy protein isolate through chemical phosphorylation[J].Journal of Food Science，1983，48（3）：716-721.

[6]宋莹，张华江.大豆蛋白功能性及改性技术研究进展[J].中国林副特产，2013（6）：80-84.

[7]Tavano O L.Protein hydrolysis using proteases：An important tool for food biotechnology[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2013，90：1-11.

[8]怀宝东，张东杰，钱丽丽，等.大豆分离蛋白改性技术的研究与发展趋势[J].中国酿造，2014，33（6）：13-16.

[9]Gao Y Z，Xu H H，Jiang L Z，et al.Surface properties and structure characteristics of soybean protein isolate by limited Hydrolysis[C]//New Technology of Agricultural Engineering（ICAE），2011 International Conference on.IEEE，2011：968-971.

[10]赵新淮，徐红华，姜毓君.食品蛋白质：结构，性质与功能[M].科学出版社，2009：333.

[11]郭兴风，刘洁，胡婷婷，等.不同酶改性豌豆蛋白的泡沫性能比较[J].粮食与饲料工业，2013（5）：27-30

[12]Nishinari K，Fang Y，Guo S，et al.Soy proteins：A review on composition，aggregation and emulsification[J].Food Hydrocolloids，2014，39：301-318.

[13]Tan M C，Chin N L，Yusof Y A，et al.Characterisation of improved foam aeration and rheological properties of ultrasonically treated whey protein suspension[J].International Dairy Journal，2015，43：7-14.

[14]Nicorescu，Loisel C，Vial C，et al.Combined effect of dynamic heat treatment and ionic strength on the properties of whey protein foams-Part II[J].Food research international，2008，41（10）：980-988.

Study on foaming property of enzyme modified soy protein isolated

JI Xiao-man，MA Chuan-guo*，WANG Hua-lin
（College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

In this paper，the effect of the foaming property of soybean protein isolated was improved by using the alkali protease to hydrolysis protein.And several influencing factors were discussed in this paper，such as reaction time，temperature，substrate concentration，enzyme dosage，and pH value.Then by the orthogonal design method the optimal conditions of alkali protease hydrolysis soybean protein isolated to improve foaming property was：time 40 min，temperature 50℃，substrate concentration 8%，enzyme dosage 0.04%（w/v），pH8. The optimal hydrolysis conditions to improve the foaming stability was：time 30 min，temperature 40℃，substrate concentration 12%，enzyme dosage 0.04%（w/v），pH9.The foaming capacity（217.50%）and foaming stability（93.10%）of modified soybean protein isolated was improved in this study.The foaming capacity and the stability was increased by 61.11%and 20.38%respectively than the raw material of soybean protein.

alcalase；soybean protein isolated；foaming capacity；foaming stability

TS252

A

1002-0306（2015）22-0164-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.026

2015－02－02

计晓曼（1990-），女，硕士，研究方向：油脂蛋白品质分析，E-mail：jixiaoman0222@163.com。

*通讯作者：马传国（1966-），男，博士，教授，研究方向：脂质化学品质研究，E-mail：mcg66@163.com。

国家863项目（2013AA102208）。