5-羟色胺在双层纳米金修饰电极上的电化学行为及测定研究

牛凌梅，连靠奇，马莉，康维钧

（河北医科大学公共卫生学院，石家庄 050017）

5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）亦称血清素（Serotoin），是色氨酸代谢产物。色氨酸在组织中经过色氨酸羟化酶和5-羟色氨酸脱羧酶的作用生成5-羟色胺，又经单胺氧化酶作用生成5-羟色醛；进一步氧化成5-羟吲哚乙酸[1]。5-羟色胺是人体内重要的神经递质，其参与睡眠、摄食、体温、学习、记忆等多种生理过程。中枢神经系统5-HT含量异常与重性抑郁障碍和自杀行为有着极其重要的联系，同时也可以影响血脑屏障通透性的改变[2]。因此，建立一种快速、灵敏检测5-HT的方法尤为重要。

目前，测定5-HT含量的方法有很多，例如：免疫法[3,4]、荧光法[5]、高效液相色谱法[6-8]、电化学方法[9,10]等。在纳米金的组装过程中，常用巯基修饰的DNA来承载纳米金，本文则利用番红花红聚合膜和含有连续腺嘌呤模块的DNA来固定双层纳米金（GNPs），用此复合膜修饰的玻碳电极来测定5-羟色胺，建立了定量测定5-羟色胺的新方法。

1 材料与方法

1.1 试剂

番红花红（SFR）购于上海化学试剂有限公司；5-HT（Fluka公司）储备液：0.01mol/L；氯金酸购于国药化学试剂有限公司；不同碱基序列的DNA购于上海生工生物工程公司（0.1 mol/L），碱基序列如下。实验中使用二次水，其它试剂均为分析纯。所有实验均在室温下进行（约为25℃）

ss-DNA (1): 5'-AAA TAC GCC ACC AGC TCC-3'

互补 ss-DNA (2): 5'-AAA GGA GCT GGT GGC GTA-3'

ss-DNA (3): SH-5'-TAC GCC ACC AGC TCC-3'

互补 ss-DNA (4): SH -5' -GGA GCT GGT GGC GTA-3'

1.2 仪器

CHI440C（上海辰华仪器有限公司）；电极采用三电极系统：铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，工作电极为裸玻碳电极（GCE）或纳米金修饰的玻碳电极。所有电位均相对于 Ag/AgCl参比电极而言。

1.3 纳米金修饰电极的制备

将裸玻碳电极置于Al2O3粉末的悬浆之中进行打磨至镜面，取出，依次用1：1的HNO3、1：1的丙酮、二次蒸馏水，各超声清洗5分钟，氮气吹干。参照文献[11]，将聚番红花红修饰好的电极（GCE/poly(SFR)）浸入到纳米金溶液中10 h，取出，用蒸馏水冲洗干净，得到单层纳米金修饰电极（GCE/poly(SFR)/GN）。再将此电极浸入预先杂交好的DNA（由ss-DNA (1)和与其互补的ss-DNA (2) 47℃杂交1小时）溶液中2 h，取出，冲洗干净，即为DNA纳米金修饰电极（GCE/poly(SFR)/GN/DNA）。最后，将此修饰电极再次浸入到纳米金溶液中2 h，取出，即可制得双层三维分布的纳米金修饰传感器（GCE/poly(SFR)/GN/CA DNA/GN）。巯基DNA由ss-DNA (3)和ss-DNA (4) 杂交制备，其余同上。

2 结果与讨论

2.1 GCE/poly(SFR)/GN/CA DNA/GN对5-HT的电催化作用

利用循环伏安法研究了5-HT在裸玻碳及修饰电极上的电化学响应。由图1可看出，在裸玻碳电极（a）表面，5-HT氧化峰电流为3.59×10-6A。而在CA DNA承载的双层纳米金修饰的玻碳电极（b）表面，5-HT峰电流却大大增加（1.832×10-5A）。相对比的，在巯基DNA承载纳米金修饰的玻碳电极表面（c），峰电流为（1.588×10-5A）。这是因为，有报道称连续的腺嘌呤碱基与纳米金的亲和力与金硫键相当，且能够使吸附的DNA更加有序。因此，有序的DNA必将承载更多的纳米金，而纳米金是电子的良导体，能够加速电子的传递，结果必然使得5-HT的氧化变得更加容易，峰电流大大提高。

图1裸玻碳电极（a）、GCE/poly(SFR)/GN/CA DNA/GN（b）和GCE/poly(SFR)/GN/巯基DNA/GN（c）在5-HT溶液中的循环伏安伏安曲线；5-HT浓度：1.0×10–6 mol/L；pH 7.5。Fig. 1CVs at bare GC electrode (a), GCE/poly(SFR)/GN/CA DNA/GN（b）and GCE/poly(SFR)/GN/mercapto DNA/GN（c）in the 5-HT solution; Concentration: 1.0×10–6 mol/L; pH 7.5.

2.2 纳米金修饰膜引起5-HT氧化电流的升高

本实验研究了各层修饰膜对5-HT测定的影响。随着在纳米金溶液中浸泡时间的延长，所吸附的纳米金亦随之增加。结果，由于修饰电极对5-HT的氧化能力逐渐增加而导致了5-HT在此修饰电极上的氧化电流也随之增大。但当时间超过10h后，氧化电流趋于平缓（1.3×10-5A），说明吸附的纳米金已趋于饱和。因此，选用10h作为第一次纳米金的浸泡时间。但由于DNA对5-HT的氧化没有电催化能力，故随着在DNA中浸泡时间的延长，5-HT的氧化峰电流随之降低。在浸泡1.8h后，DNA吸附达到了饱和，因此选用1.8 h作为DNA的浸泡时间。虽然此时DNA修饰的电极有最低的电催化活性，但它却可以吸附最多的纳米金。随着再次浸入纳米金溶液时间的延长，5-HT的氧化峰电流又继续上升，直至浸泡2.0 h后趋于饱和，从而达到5-HT的最大氧化峰电流（1.8×10-5A）。相对于单层纳米金修饰的电极，其电流增长了38 %。各层膜浸泡时间对测定结果的影响如图2所示。

图2各层修饰膜浸泡时间对5-HT测定的影响A：第一层纳米金膜；B：CA DNA修饰膜；C：第二层纳米金膜；5-HT浓度：1.0×10–6 mol/L。Fig. 2Effect of accumulation time of each layer on the determination of 5-HT; a: the fi rst layer of GNPs; b: CA DNA monolayer; c: the second layer of GNPs; 5-HT concentration: 1.0×10–6 mol/L.

2.3 溶液pH值对5-HT测定的影响

在不同pH值的磷酸缓冲溶液中研究了支持电解质对5-HT测定的影响（图3）。结果发现，5-HT的氧化峰随着溶液pH值的增加而逐渐增加，并在pH 7.5处达到最大值，之后逐渐减小。故本实验中选用pH 7.5缓冲溶液作为支持电解质。

图3不同pH缓冲溶液对于5-HT测定的影响5-HT：1.0×10–6 mol/L。Fig.3Effect of pH on the determination of 5-HT. Concentration of 5-HT: 1.0×10–6 mol/L.

2.4 poly(SFR)/GN/CA DNA/GN修饰电极的稳定性

在1.0×10-6mol/L的5-HT溶液中考察了纳米金修饰电极的稳定性。20次连续测定之后，5-HT峰电流的改变在4 %之内，将此修饰电极置于磷酸缓冲溶液（pH 7.0）中60天后，仍保留90 %的电催化活性。电极活性随时间变化如图4所示。

图4电极活性随时间的变化曲线Fig.4Variation of the electroactivity of electrode with time.

2.5 干扰物测定

研究了各种干扰物对浓度为1.0×10-6 mol/L 5-HT测定的影响。在相对误差5.0 %的限度之内，500倍的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-，50倍的L-赖氨酸、葡萄糖、20倍的谷氨酸、甘氨酸、胱氨酸对于测定不产生干扰，说明此修饰电极有很好的选择性。各种干扰物存在下，5-HT所测的相对误差如表1中所示。

表1各种干扰物对5-羟色胺测定结果的影响Tab. 1Effects of interferents on the determination of 5-HT

2.6 分析应用

利用循环伏安法（CV）研究了5-HT在GCE/poly(SFR)/GN/CA DNA/GN修饰电极上的线性关系（图5）。发现5-HT的氧化峰电流在6.0×10-8mol/L ～ 1.0×10-6mol/L范围内均随着其浓度的增加而线性增加，检出限达到2.0×10-9mol/L。其线性方程为ip= 2.2715 + 16.6543C ( r: 0.9970, C:10-6mol/L，ip：10-6A)。利用此电极对血液样品（采自河北医科大学校医院）中的5-羟色胺进行了测定。将全血离心分离，取上清液，初始含量未知。将此样品平行测定四次，第一次不加标准品，测定结果为0.42μmol/L，此含量作为血清样品中的初始量。其余三次，向样品中分别加入标准品的量为0.10, 0.30,0.50μmol/L进行测定，所测标准品的加标回收率在80%～100%之间。结果如表2中所示。

图55-HT不同浓度的循环伏安曲线；5-HT浓度（10–6 mol/L）：(1)0.06 (2) 0.07 (3) 0.08 (4) 0.2 (5) 0.3 (6) 0.4 (7) 0.6 (8) 0.8 (9) 1.0。Fig. 5 CVs of 5-HT at different concentrations. Concentration of 5-HT (10–6 mol/L): (1) 0.06 (2) 0.07 (3) 0.08 (4) 0.2 (5) 0.3 (6) 0.4 (7)0.6 (8) 0.8 (9) 1.0.

表2血液样品中不同浓度5-羟色胺的测定结果Tab. 2Results for the determination of 5-HT in human serum

结论

本文组装了含有连续腺嘌呤碱基模块的DNA（CA DNA）——双层纳米金修饰的玻碳电极，并利用此修饰电极对5-HT的电化学氧化过程进行了研究，发现此修饰电极能起到明显的电催化作用。在此基础上考察了各修饰层膜的修饰时间，支持电解质等对5-HT的测定影响。此修饰电极稳定性好，选择性高，已用于实际样品的测定，收到满意的效果。

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