UPLC-ELSD法测定配方奶粉中的低聚果糖

2015-04-23孙久玉陶大利

生命科学仪器 2015年1期

孙久玉，陶大利

（1. 完达山乳业股份有限公司，哈尔滨 150090；2. 农业部乳品质量监督检验测试中心，哈尔滨 150090）

低聚果糖（Fructooligosaccharide，FOS），又名寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，天然低聚果糖存在于多种植物或水果中，如菊苣、菊芋、香蕉、洋葱及蜂蜜等。工业上采用现代生物工程技术果糖基转移酶转化、精制、浓缩而成[1]，它主要由蔗果三塘（GF3）、蔗果四糖（GF4）、蔗果五糖（GF5）组成[2]。低聚果糖具有促进肠道双歧杆菌、乳酸菌等有益菌的生长增殖，调节肠道菌群平衡，改善肠道功能[3]，促进钙的吸收[4]的功效。由于婴儿的肠道发育尚未成熟，其抗感染能力处于初始阶段[5]，所以低聚果糖在婴儿配方奶粉中得到了广泛应用。目前有关低聚果糖的检测方法主要有高效液相色谱（示差[6～10]或蒸发光散射检测器[5]）法、离子色谱（电化学检测器）[1]法，共同存在的问题一方面是仪器分析的时间长，工作效率低，另一方面由于仪器分析的时间长导致峰形变宽，大大降低了检测的灵敏度。超高效液相色谱的使用，使分析时间大大缩短，提高了检测灵敏度和分离度，同时减少了试剂（流动相）的使用量，降低了检测成本。本文使用超高效液相色谱（UPLC-ELSD）法，检测婴儿配方奶粉及中老年奶粉中的低聚果糖，分析时间短，操作简单，重现性和准确度良好，结果准确可靠。可以满足乳品企业出厂检验与品控及质检部门监督的需要。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪（美国Waters UPLC-ELSD )；高速冷冻离心机 (德国SIGMA 3-30)；SPE固相萃取装置（美国Supeleo）；旋转蒸发仪（德国IKA RV-10）；涡旋混合器（德国IKA MS 3 basic）。

乙腈色谱纯（J.T.Baker）；无水乙醇分析纯（天津科密欧化学试剂有限公司）；蔗果3糖（100%），蔗果4糖（99.2%），蔗果5糖（94.8%）标准品（和光纯药工业株式会社）：分别称取三种标准品各100mg，用50%乙腈水溶液溶解，并定容至25mL，浓度分别为4mg/mL，3.968 mg/mL，3.792 mg/mL。

1.2 样品处理

1.2.1提取称取奶粉5g（精确到0.1mg）于50mL容量瓶中，加入12.5mL 50℃超纯水，涡旋混合充分溶解样品，用无水乙醇定容至刻度，混匀。放入超声波中超声提取10min，取出放至室温，将样品转入40mL离心管中，5000转/min离心5min。吸取25mL上清液于50mL梨形瓶中，70℃减压蒸发，至液体剩余5-6mL，将剩余液体转移至25mL带刻度的比色管中，用少量超纯水分3次洗涤梨形瓶转入比色管中并定容刻度为12.5mL，混合均匀待净化。

1.2.2净化取SPE固相萃取柱，分别用5mL甲醇和5mL水活化，将备用液过柱，弃去前2mL后，再收集2mL流出液，再加入2mL乙腈混合均匀，15000转/min离心10min，过0.22μm滤膜上机。

1.2.3仪器条件

仪器：超高效液相色谱仪配蒸发光散射检测器（UPLCELSD）；色谱柱：BEH Amide 2.1×100mL，1.7μm；流速：0.15mL/min；喷雾压力：30psi；漂移管温度：55℃；增益：1000；进样量：4μL；流动相：A(水)，B（乙腈）梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table.1Gradient elution program

1.2.4标准曲线绘制

分别吸取三种标准储备液各0.5mL，1.0mL，2mL，3mL，5mL于25mL容量品，用50%乙腈水溶液定容混匀，过0.22μm滤膜上机，按上述仪器条件进样得到峰面积，用浓度和峰面积按log-log方式绘制比准曲线。按上述仪器条件获得图1和图2。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理及色谱条件的优化

2.1.1样品溶剂由于受BEH Aamide色谱柱极性的限制，对样品溶剂的极性比较敏感，从简化样品处理步骤的角度考虑，应优先选择乙醇水作为样品溶剂，但通过比较发现，用乙醇水作溶剂比用乙腈水作溶剂的色谱峰明显变宽且不尖锐，不利于复杂基质中目标物的分离,并且大大降低了检测的灵敏度。故本方法采用乙腈水作样品溶剂。

2.1.2样品提取的选择在大部分的文献中都采用乙醇提取的方式，提取效率较高，为满足测试溶剂的要求，简化处理步骤，本人尝试采用乙腈水作为提取溶剂，试验结果见(表2)

表2不同比例乙腈溶液对样品处理的影响Table.2The in fl uence of different proportion of acetonitrile solution to sample processing

由此表可以看出直接用乙腈水提取低聚果糖的效率很低，方法不可取，所以采用乙醇水作为提取溶剂，则需要通过旋蒸的方式除去乙醇，再置换成乙腈水的体系，在实验中发现当乙腈的比例大于50%时，容易使乙腈和水溶液分层无法混合，最终采用乙腈：水（v/v1:1）混合。

2.1.3样品净化由于样品提取过程中会同时提取出大量的脂类物质，在色谱分离中有一定的干扰，测试样采用通过的方式过C18固相萃取柱，可有效吸附样液中脂类物质，最大程度的降低对目标物的干扰。由于乙腈比乙醇沉淀蛋白的能力强，且乙腈的比例越大，对蛋白的沉淀效果越好，而在上机测试时流动相中乙腈的比例高于样品中乙腈的比例，为防止测试过程中部分蛋白在色谱柱中继续沉淀，阻塞色谱柱，上机测试前增加15000转/min的离心，可进一步除去少量的水溶性蛋白，降低蛋白在色谱柱中重新析出沉淀的风险，延长色谱柱的使用寿命。

2.2 方法有效性评价

2.2.1线性及检出限

由于蒸发光散射检测器设计上的原因，当固定增益的情况下，进样浓度过大，则出现平头峰无法定量，对于不同含量的样品可以采用稀释或增减增益的办法来获得理想的峰面积，进行定量。当增益调整到最大1000时，以3倍的S/N计算，按上述的样品处理方式，蔗果3糖、蔗果4糖、蔗果5糖的检出限均为20mg/100g；完全能够满足配方奶粉测试的要求。

2.2.2回收率和精密度

分别选取完达山婴儿段配方奶粉和中老年奶粉添加低聚果糖标准溶液后进行回收率测试；选取婴儿配方奶粉和中老年奶粉分别称取6份样品按（1.2）方法处理进行精密度测定。结果分别见表3、表4。

图2标准溶液与样品叠加色谱图Fig.2standard solution and sample of overlapping chromatograms

由回收率和精密度实验结果表明，回收率在88.5%以上，相对标准偏差RSD均小于1.5%，完全能满足婴儿配方奶粉中低聚果糖的检测要求。

3 结论

本文建立超高效液相色谱(UPLC-ELSD)测定配方奶粉中的低聚果糖含量的方法，并优化了样品的处理，通过改变样品溶剂使色谱峰更加尖锐，提高了分离度和灵敏度；通过净化大大降低了测试过程中对目标物的干扰，延长了色谱柱的使用寿命，由于采用超高效液相色谱系统，流速仅为0.15mL/min，大大的节省有机溶剂，缩短了分析时间，提高了工作效率。结果表明：蔗果3糖、蔗果4糖、蔗果5糖的检出限均为20mg/100g；回收率高且稳定，准确度和精密度高，完全能够满足配方奶粉测试的要求。